作者beautyfish (天使光)
看板Biotech
标题[求救] DNA总是切不好
时间Thu May 1 23:14:47 2008
我目前在做 Southern Blot 已经卡很久了
跟实验室其他人用一样的产品跟Buffer但很常没成功
通常都是背景值过深 所以无法看出对比
但是我洗片的流程都有按照protocol再延长一倍的时间
前阵子好不容易做出来
但最近要做repeat data又发现DNA切不好
我用的酵素是EcoR1与BamH1分别对我的DNA做裁切
用的DNA浓度是20ng
之前用这样的量切Kpn1+Bgl2都切的很好
但切单一酵素时大多数的DNA跑电泳後都累积在上面没有切开
就算我减少DNA的量还是一样= ="
我的切法是取20ng的DNA先用1.5 micro liter的酵素切3小时
3小时後再补1.5 micro liter 的酵素切 O/N
请问有什麽方法可以让我的DNA切的比较好?
另外有减少Southern背景值的方法吗?
我用的hybridazation temp.是60度C
非常的感谢版上大大的帮忙
谢谢
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在大海中泅泳的鱼
你会不会也想要像飞鸟一样翱翔
还是心甘情愿的待在你的 水蓝色天堂
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◆ From: 210.209.240.239
1F：推 nixo:DNA纯化的乾净吗？ 05/02 00:12
2F：推 HEYHEYHEY:20ng很少耶 05/02 00:36
3F：推 dankai:DNA品质很重要~~不然切不动!!你做的浓度也太太太低了~ 05/02 00:54
4F：推 MacBook:看你enzyme加得量 我猜你是想讲20microgram吧 05/02 01:35
5F：→ MacBook:最後wash完再放到便当盒里用0.1xSSC 喇喇～ 05/02 01:36
6F：→ MacBook:为什麽要三小时候再补加? 05/02 01:38
7F：推 enisx:他补加的目的应该就是怕酵素不够力所以多加些 05/02 07:33
8F：→ enisx:用较high stringency的条件,同楼上说用低%的SSC与再高一点的 05/02 07:35
9F：→ enisx:温度 我都用62度 05/02 07:37
10F：→ enisx:EcoRI和BamHI 37度切个3hr就够啦不用切o/n(切不好可能你的 05/02 07:39
11F：→ enisx:enzyme或是reacction buffer有点问题 05/02 07:40
12F：→ beautyfish:我的DNA里面的RNA的确较多 所以切酵素的时候我有添加 05/02 10:29
13F：→ beautyfish:RNase一起下去切 另外我用的浓度是micro gram 05/02 10:29
14F：→ beautyfish:昨天的确打错了 = =|| 05/02 10:30
15F：→ beautyfish:而enzyme跟reaction buffer都是新买的耶>"< 05/02 10:30
16F：推 blence:BamHI请尽量不要切o/n,你只要E跟B都各加2ul直接切2h就够了 05/02 12:40
17F：推 enisx:RNase理论上不会影响digest 05/02 12:53
18F：推 alaric:先确定是哪一个enzyme切不动? buffer是否需要加BSA? 05/03 03:12
19F：→ beautyfish:谢谢大家的热情回答 後来已经有切好了 谢谢^^ 05/03 15:42
20F：推 enisx:可否把你动了什麽条件,使得实验得以成功跟大家分享一下!:D 05/03 21:51