作者MrCAKE (Keep Working)
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标题Re: [求救] DNA总是切不好
时间Fri May 2 12:14:12 2008
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
: ◆ From: 210.209.240.239
: 推 nixo:DNA纯化的乾净吗？ 05/02 00:12
: 推 HEYHEYHEY:20ng很少耶 05/02 00:36
: 推 dankai:DNA品质很重要~~不然切不动!!你做的浓度也太太太低了~ 05/02 00:54
: 推 MacBook:看你enzyme加得量 我猜你是想讲20microgram吧 05/02 01:35
: → MacBook:最後wash完再放到便当盒里用0.1xSSC 喇喇～ 05/02 01:36
: → MacBook:为什麽要三小时候再补加? 05/02 01:38
: 推 enisx:他补加的目的应该就是怕酵素不够力所以多加些 05/02 07:33
: → enisx:用较high stringency的条件,同楼上说用低%的SSC与再高一点的 05/02 07:35
: → enisx:温度 我都用62度 05/02 07:37
: → enisx:EcoRI和BamHI 37度切个3hr就够啦不用切o/n(切不好可能你的 05/02 07:39
: → enisx:enzyme或是reacction buffer有点问题 05/02 07:40
: → beautyfish:我的DNA里面的RNA的确较多 所以切酵素的时候我有添加 05/02 10:29
: → beautyfish:RNase一起下去切 另外我用的浓度是micro gram 05/02 10:29
: → beautyfish:昨天的确打错了 = =|| 05/02 10:30
: → beautyfish:而enzyme跟reaction buffer都是新买的耶>"< 05/02 10:30
你的DNA纯度可能有问题
像是protein、polysaccharides、RNA等抽DNA时残存的污染
都可能影响限制脢的作用
我建议可以再纯化一下你的DNA
或是限制脢作用时把总体积放大来切
像是把20ul的总体积放大成200ul(限制脢的量不用改变)
应该就可以有效的改善切不好的现象
之後再浓缩体积loading就可以了
Good luck!!!
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◆ From: 140.112.60.16
1F：推 yaliu:20ug很浓耶...这样total 3ul切,真的切的完吗? 基本上我用 05/02 13:12
2F：→ yaliu:NEB的EcoRI 效率跟他产品写的差很多 新品也一样= =||| 05/02 13:14
3F：→ MrCAKE:这很难说 不过如果DNA品质有问题的话 05/02 13:21
4F：→ MrCAKE:多加酵素无法有效解决问题 05/02 13:21
5F：→ MrCAKE:3ul一般来说是30U 如果切不完当然可以补 05/02 13:23
6F：→ MrCAKE:反正EcoR1和BamH1都不贵 不过我还是觉得问题出在DNA 05/02 13:24