作者aggaci (台南工作的基隆人)
看板Biotech
标题Re: [求救] site-directed mutagenesis
时间Wed Nov 16 18:11:23 2011
※ 引述《aggaci (台南工作的基隆人)》之铭言：
※ 引述《nhxcyge (人生就像个不可逆反应)》之铭言：
: 我现在是做A基因的点突变，
: 用的方法是利用complement primer 25bp，而突变设计在中间
: 利用这组primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小约6.7kb
: 目前卡在PCR出来的产物很少很少，以致於做transform後都没有colony长出来…
: 曾想过把多管PCR产物跑胶(先以DpnI digest)後，把少量的产物集中一起elution
: 但浓度还是很低(1.1 ng/ul)。
: 另外因此突变点位在基因末端(离stop codon约30bp,全长约1.4kb)，所以用下述方法
: 心想应该行不通
: F1----------> F2--------->
: ------------------------------------------------------
: ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
: ------------------------------------------------------
: R1<---------
: R2<----------
: 二段PCR产物overlap处为mutation site，不过会变成F1、R1夹出来1300多bp而F2、R2
: 夹出来可能100bp不到的产物，再将二个大小差距那麽大的产物加在一起觉得不太可行。
: 所以想请问版上有人遇过这种状况吗？
: Primer重新order过了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
我的方法不一样 提供给大家
我的是
P---------m----------->
------------------------------------------------------ m:mutation
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
<---------------P
这样做PCR 因为没重叠所以不太会形成primer dimer 会比较好做
要注意的地方在於我的primer尾端会加phosphate
因为这样做出来是linear DNA所以之後拿去作ligation......
效率不错!!我觉得比传统quickchange好做很多
另外我用的是fynzyme的phusion pfu
这pfu超好用 作的 超准 超快 超多
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单身不代表寂寞，寂寞是走在一个不爱你的人身边的时候。
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◆ From: 140.116.253.121
※ 编辑: aggaci 来自: 140.116.253.121 (11/15 23:41)
※ 编辑: aggaci 来自: 140.116.253.121 (11/15 23:42)
※ 编辑: aggaci 来自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)
1F：推 Ianthegood:推phusion 超贵超好用 11/16 00:35
2F：→ dodomilk:这方法听起来不错！ 照你这样讲的话，primer不事先加P应 11/16 01:01
3F：→ dodomilk:该也是可以的，只是之後要多一道PNK的步骤 11/16 01:01
4F：→ aggaci:对阿 要多磷酸化这一步 11/16 01:11
5F：推 micocat:有重叠的好处是不用ligation,pcr完就可以transform了 11/16 01:34
6F：→ micocat:不重叠的话 就是blunt end ligation罗 11/16 01:35
7F：推 mattmatt:phusion+1 上面+1..不用ligation省事很多 11/16 10:14
8F：推 dodomilk:blunt end self ligation超好作的，不可能会失败... 11/16 11:30
9F：→ aggaci:真的 但不管怎样 肯定比TWO-STEP pcr好做很多 11/16 11:52
10F：推 silverberry:想请问楼上们，把 plasmid 做一圈出来的方法， 11/16 15:01
11F：→ silverberry:要怎麽确定没有不小心错在 plasmid 上? 11/16 15:01
12F：→ silverberry:我们实验室都很怕死的做 2 step PCR 11/16 15:02
13F：→ silverberry:虽然速度没有慢很多，但是还是很多步骤。 11/16 15:02
简单阿
我们lab的做法是 insert 没错就好
之後把insert 切下来再接到新的vector上
2 step pcr难用又难做
14F：→ silverberry: 请大家给点建议~~~ 谢谢^^ 11/16 15:03
15F：推 dodomilk:用pfu 11/16 17:30
PFU还是无法保证vector sequence有没出错
除非你去对整个vector定序
所以最安全的做法是 把insert 切下来再接到新的vector上
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◆ From: 140.116.253.121
※ 编辑: aggaci 来自: 140.116.253.121 (11/16 18:12)
16F：→ lovesteve:我的作法是PCR产物处理DpnI後 产物+PNK+Ligase 在16度2h 11/16 19:12
17F：→ lovesteve:效果也不错! 11/16 19:13