作者UIOP7945 (~"~)
看板Biotech
标题[求救]酵素活性测试之lysis buffur 选择
时间Thu Feb 6 22:11:17 2014
各位先见好:
小弟目前做的研究是用
化学分子探针标定细胞萃取液的蛋白质
探针的本身是 ligand-crosslinker group-tag 组成
目标蛋白质主要是 CYP450 膜蛋白(主要位在内质网与粒线体中)
从细胞萃取出来的蛋白必须是有活性 non-denuturing
与探针作用一段时间後才跑 SDS-PAGE 作分析
在此要求上 cell lysis buffer 选择
市面上常见的 RIPA NP-40 由於含 SDS所以并不适合
而non-denuturing lysis buffer 又都含有 EDTA
(由於 EDTA会与 CYP中的 heme螯合会破坏该蛋白的活性)
因此打算自己配，参考文献的配方如下
25 mM Hepes, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 7.5, 1% NP-40
要破的细胞是前列腺癌细胞 H295
步骤是加入萃取液後超音波震 5秒再放冰浴中 5分，重复此步骤 5次
不知道这样的 lysis buffer配方会不会太温和反而无法萃取出足量的蛋白呢?
感谢各位的意见
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