作者hsuan7919 (阿头)
看板Biotech
标题[求救] HPLC分离後的胜肽，合成回来後RT改变
时间Wed Feb 19 00:45:51 2014
小弟最近以HPLC将一个发酵产物分离出许多不同分子量的fraction
column:TSK G2000swxl (size exclusion chromatography)
mobile phase:KH2PO4 100 mM + 1M NaCl + 1mM EDTA
detector:UV
之後将这些fraction拿去以LC-MS/MS监定各根fraction中可能存在的序列
再分析各根fraction中哪段序列的可信分数为最高
将这段选定序列，送去外面生技公司做胜肽合成
合成回来的peptide我拿去再以同样条件HPLC打一次
发现此peptide的RT，和我一开始以HPLC分离下来的fraction的RT不同(差很远)
有想过是不是溶解度的问题
後来我也依照peptide性质以适合的有机溶剂溶解
但跑出来结果，和以水溶解没有差别==
就分子筛column来说，就算某根fraction内可能的氨基酸序列有数条
那RT差一点点或许可以接受
但RT差有点多....我真的想不出是什麽原因造成的....
而且合成胜肽的peak的RT range也有点宽...不像是正常peak...
附图在此
https://www.dropbox.com/s/idn79zmeiuw6ro6/%E5%9C%96%E7%89%871.jpg
再麻烦各位有经验的大大帮我解惑了!!!感恩~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 119.15.236.32
1F：推 huangsw:如果是peptide, 需要考虑是否有二级结构的问题 02/19 10:51
2F：推 Peetu: 这只column我用过，和成的peptide可能是不够纯 10/28 00:01
3F：→ Peetu: 分析出来的peak才会有点宽，因为是平均分子量的关系 10/28 00:02
4F：→ Peetu: 这支column主要也是依据分子量分析，样品可以先跑看看SDS 10/28 00:04
5F：→ Peetu: 就可以知道分子量正不正确了，不一样的话当然peak会差很多 10/28 00:05
6F：推 Peetu: 另外上机之前，建议将peptide变性後再去上机 10/28 00:08