作者sss79818 (Sosad)
看板Biotech
标题[求救] Annexin V-FITC/PI跑流式细胞仪
时间Fri Mar 7 20:37:04 2014
不好意思 有几个问题想请教一下各位大大
小弟最近在用流式细胞仪看细胞死亡途径时遇到了一些问题
我的实验是用光动力治疗在细胞体内产生自由基来杀死Hela cell
实验的设计是在照光後6 hr/24 hr收集起来
染完Annexin V-FITC/PI之後去跑flow来判断细胞的死亡途径
但是因为flow仪器预约时段的关系
我是把照光後6hr的细胞在染色完之後fix起来
保存到隔天把24hr的细胞染完之後再一起拿去跑
结果在用positive control(这组也是前一天染的)抓gate的时候发现
不管是单染FITC或是双染的组别都看不到FITC的讯号
而单染PI与双染的组别则都抓的到PI的讯号
这应该代表我positive control的作法没有问题?
(kit里的protocol是说把细胞泡在3.7% formaldehyde里面冰浴30min)
如果protocol没问题的话 只看的到PI 没有FITC是很怪的一件事
我有问过实验室学长 他是说FITC染完之後放到隔天太久 这样讯号会变很弱
他建议先fix起来隔天要上机之前再染
这边我有个问题
如果先fix的话 膜的结构会不会受到影响?
我们fix都是用3.7% formaldehyde固定20分钟
而positive control也是用formaldehyde做 而且已经证实染的到PI
这样不就代表膜已经受损到足以让PI通过了吗?
这样先fix再染会不会让普通的正常细胞也变成FITC+/PI+?
我们学长是说他没染过apoptosis
他不知道这样会不会有影响
如果会有影响的话
以各位的经验FITC在染色完毕之後避光4度C保存大概能撑几小时呢?
另外
细胞凋亡在启动6小时後 应该仍是会处在早期膜外翻的状态吗?
我查过一些光动力治疗相关的paper
有的抓照光後5小时後观察 有的抓6小时後观察
不晓得抓6小时这个时间点O不OK?
问题有点多 麻烦大家了
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.182.185
1F：推 qiet:你的fixation buffer是用binding buffer稀释吗? 03/07 21:24
2F：→ qiet:要是没有Ca+ annexin V可能就掉了 自然就看不到萤光 03/07 21:25
3F：→ qiet:FITC不会掉的那麽快, 放一两天应该都测的到 03/07 21:26
4F：→ grox:Fix完不就全挂了吗...? 当时是收下来直接加Annexin V染 03/08 08:34
5F：→ grox:我是用BD的 03/08 08:37
6F：推 qiet:要先染好再固定就可以了 03/08 12:40
7F：→ sss79818:感谢楼上二位 我想我找到原因了 我们LAB的fix buffer 03/08 16:15
8F：→ sss79818:里面并没有Ca+ 03/08 16:16
9F：→ sss79818:如果我加点CaCl2把它配成里面有Ca+2.5mM再fix应该就OK 03/08 16:19
10F：→ sss79818:了吧? binding buffer里的浓度也差不多是这样 03/08 16:19