作者ayenyayaya (ayenya)
看板Biotech
标题[求救] DNA 纯化问题 (DNA extraction kit)
时间Thu Mar 13 14:03:54 2014
目前我正进行cloning
将某PCR片段塞进某plasmid
目前遇到的问题是
我把 1 ug plsmaid用restriction enzyme (总体积10 ul) 切过之後
将之进行纯化
利用Geneaid Gel/PCR DNA Fragmants Extraction Kit
1. 首先与DF buffer 混合
2. 再过 DF column 离心 6000g 30s
3. 用75%EtOH wash buffer清洗 离心 6000g 30s
4. 以最高速离心(2 min)方式风乾後 加入ddH2O或elution buffer
5. 静置 2 min 等 DF colume 的 filter 吸收
6. 以最高离心将DNA溶出
但所得之DNA浓度很低 仅0.010 ug/ul
260/280 = 2.3 260/230 = 0.1
目前不知道出甚麽问题
纯化前跑胶也的确有正确的band (4000 bp)
另外我纯化PCR products(600~1000bp)是正常的
使用其他厂牌纯化kit也是相似结果
想来请教各位有经验的前辈
感谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.228
1F：→ ai760721:我觉得纯化完 10 ng/ul还满正常的阿XD 03/13 14:55
2F：→ ai760721:忘记问你是只切一刀 还是切一段下来? 03/13 14:56
3F：→ blence:我觉得你什麽都没写,先猜你用100ul,结果就正常 03/13 14:57
4F：→ blence:不过打这麽多字,却没有提到你PCR那部分是怎样的正常 03/13 15:05
5F：→ ayenyayaya:我用10ul回溶 只切一刀 03/13 17:23
6F：→ ayenyayaya:PCR 产物纯化後 用20ul回溶都还有0.2 ul/ug 03/13 17:26
7F：→ ayenyayaya:主要是切过的plasmid yeild不到10% 感觉有点疑惑 03/13 17:28
8F：→ ayenyayaya:我有试过一次切10ug的plasmid然後去纯化 产量也无提升 03/13 17:29
9F：→ micocat:为何只用10ul回溶？你有看说明书吗 03/13 18:25
10F：→ blence:如果这10ul是自己决定的,我想猜这实验从切plasmid就不顺利 03/13 18:56
11F：→ ayenyayaya:10 是学长做过是可行的 所以照做 03/13 19:57
12F：→ ayenyayaya:我试过照说明书用50也是一样 03/13 19:58
13F：→ aceliang:看不太懂是做gel extraction还是单纯clean up 03/13 20:19
14F：→ ayenyayaya:gel extraction 跟 clean up 结果都是相同的 03/13 20:45
15F：→ KittyGod:你可以试试看加多点水50-100纯化後再风乾 这样应该可以 03/13 22:15
16F：→ KittyGod:回收比较多 03/13 22:16
17F：推 mesenchymal:可以把步骤六的产物 再回到步骤四做一遍,也就是 03/13 22:22
18F：→ mesenchymal:elution 2次 03/13 22:22
19F：推 milkpa:回溶的时候60-65℃加热一两分钟 03/13 22:30
20F：→ blence:有点好奇既然处理PCR的部分没问题,又这plasmid换别kit也同 03/13 23:37
21F：→ blence:样状况,怎麽会猜测是extraction kit的问题? 标题引导了答案 03/13 23:38
22F：→ blence:而且如果已用了50,却只先说10ul,只会引导出你已试过的方向 03/13 23:45
23F：→ blence:另外文中的流程跟gel extract差一个W1步骤,这也是模糊的点 03/13 23:48
24F：→ blence:总之现有的尝试你应该试过不少了,你如何怀疑问题在这kit？ 03/13 23:51
25F：→ xxtomnyxx:你有试过拿纯化後的产物去跑胶吗？load 个 5/10 ul 试试 03/14 09:12
26F：→ ayenyayaya:我文中应该没说我怀疑kit有问题QQ 03/14 09:23
27F：→ ayenyayaya:是想问说有没有其他可能可以改善的点 03/14 09:25
28F：→ ayenyayaya:纯化後的plasmid 我全load跑胶是啥都看不见 03/14 09:26
29F：→ ayenyayaya:另外感谢上面的建议 我有试过可以提升一点点的产量 03/14 09:30
30F：推 elelith:我有个问题... 为何binding和washing离心的转速只有6000g? 03/14 10:21
31F：推 bluesnow1122:我用一样的kit 切完之後会先跑胶 切下之後再回收 03/14 22:03
32F：→ bluesnow1122:离心都是用13000rpm 03/14 22:04
33F：→ bluesnow1122:我的plasmid大小是4.5k 所以回收这个大小是没问题的 03/14 22:08
34F：→ bluesnow1122:纯化後是测不太到 但是loading是有band的 03/14 22:09
35F：推 conective:胶回收可能有问题 没溶乾净的话 纯化前的量就少了 03/15 03:25
36F：推 conective:胶回收可到70度, 回溶的水65-70度 03/15 03:29
37F：→ ayenyayaya:感谢各位帮助 转速是按照protocol所做 03/15 08:44
38F：→ ayenyayaya:溶胶与回溶温度问题有试过了 但无改善 03/15 08:47
39F：→ ayenyayaya:目前我只能重复一直做 做到有成功ligation&transformat 03/15 08:49
40F：→ ayenyayaya:ion 03/15 08:49
41F：→ xxtomnyxx:加 DF 後加热 60~65℃，每 1 分钟 vortex 一次直到完全 03/15 14:07
42F：→ xxtomnyxx:溶解，再 vortex 後 spindown，然後放到 4℃ 降温後再过 03/15 14:08
43F：→ xxtomnyxx:column。 这是我的做法，我之前发现如果融胶後的 DF 温 03/15 14:10
44F：→ xxtomnyxx:度太高，会让 DNA 回收的产量减少。 03/15 14:10
45F：→ blence:我说的kit问题是抽kit过程的问题,不是kit本身,你的标题写着 03/15 17:39
46F：→ blence:DNA extraction kit,内容又附kit流程,当然会引导这个方向 03/15 17:40
47F：→ blence:既然你不觉得kit本身,抽的流程又与PCR一样,何不探讨plasmid 03/15 17:41
48F：→ blence:切之前的浓度,切後的状况,以及不切,等同浓度直接跑胶纯化? 03/15 17:43
49F：→ blence:或许你也可能都试过了就是(只是你文章也没说试过这些) 03/15 17:47
50F：→ blence:其实第一个推文就写了,而且做cloning,10ng/ul已经很够用 03/15 17:52
51F：→ blence:比较觉得怪怪的地方反而是你的PCR竟然纯化出4ug,大概只有特 03/15 17:53
52F：→ blence:殊实验才会这样,这应该pool很多管吧,一般用途反而怪怪的 03/15 17:55
53F：→ blence:而且你做clone,一般双切只有10ul,很难避免star activity 03/15 17:57
54F：→ blence:如果RE有千放少,也会担心切不好;若只是单切,那追求高浓度反 03/15 17:57
55F：→ blence:而造成之後self-ligate的现象增多(尤其你切完没说有CIP) 03/15 17:58
56F：→ blence:附带一提,plasmid的4k都是假设切完前後一致,该不会差很多吧 03/15 18:03
57F：推 chaunen:单切一定要做CIP(or AP) 挑过1k颗菌cPCR的路过 03/17 09:45
58F：→ chaunen:老实说, 我切胶纯化的回收率不知为啥总是很低25%-40% 03/17 09:47
59F：→ chaunen:OD260/230 时常过高(<1) 初始low melting gel重<300mg 03/17 09:51
60F：→ chaunen:最後wash也两次 13k rpm 3mins後 还会65度C 乾3mins 03/17 09:52
61F：推 chaunen:有时候水加下去会在膜表面形成水珠 吸不下去 有解吗QQ? 03/17 09:57
62F：→ blence:只凭回收率太低有太多可能;水无法吸收则是膜太乾了 03/18 00:59
63F：→ satasumi:切胶用的gel先借别人家的不同牌的,看是不是纯度不良 03/27 18:47