不好意思 有个问题想请教一下各位 我最近在用DCFH-DA来侦测光动力治疗在细胞内产生的ROS 实验是使用搭载亚甲基蓝的奈米粒子 在先前的实验中已经证实过在溶液里经过雷射刺激後会产生ROS了 DCFH-DA是跟sigma买的 买回来之後是先在酒精里面配成10 mM溶液 再用PBS稀释10倍成1 mM stock solution 平常是冰在-20度C冰箱里避光保存 实验protocol如下: 1.Hela cell seeding density: 5000#/well in 96 well plate Culture medium: DMEM high glucose w/ 10% FBS and 1% PSA 2.After 1 day of incubation, these cells were incubated with mixed solution of culture medium (w/o FBS) and DCFH-DA stock solution at a ratio of 100:1 for 30 min in incubator 3.PBS washed x3 to remove excess DCFH-DA. 4.加入搭载亚甲基蓝的奈米粒子培养2hr 5.把奈米粒子移除掉之後，每格加入少许PBS以防止well完全乾掉 6.以660nm雷射照射4分钟激发亚甲基蓝以产生ROS 7.用萤光显微镜观察 我在进行到第三步的时候发现细胞几乎全部都被洗掉了 一开始以为是洗3次太多 我就改成只洗一次 没想到还是掉光了 硬着头皮做下去 那些极少数还没掉的细胞的萤光强度也是非常非常低 实验组与控制组之间几乎没有差异 在进行实验之前我都有先用显微镜观察过Hela cell 贴附情形都还蛮不错的 所以应该不是细胞健康状况的问题 我稍微查过一些文章发现有人DCFH-DA是配在DMSO里面 第二步那边有人是用PBS来稀释 请问会是这些原因吗? 我们LAB里面没有人做过 只好上来求救了 感谢各位 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 112.104.64.239