作者bluesnow1122 (蓝雪)
看板Biotech
标题[求救] 切位是正确的但是切不下来
时间Thu Mar 27 11:24:06 2014
我设计基因左右两边不同的切位(XbaI/KpnI)的primer(有多加4个mer)
PCR之後加A,ligation到pGEMt-easy
之後抽plasmid送定序,序列是对的,切位都在
切EcoRI OK
跑基因全长的PCR OK
跑M13F+M13R OK
唯独切XbaI和KpnI切不下来...
XbaI和KpnI确定没有问题
我用同样的条件切另一个clone的基因是可以切下来的
我是先切XbaI 1HR 再切 KpnI-HF 30 mins (NEB)
想请问有没有什麽问题是我没有考虑到的? 谢谢~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.117.93.237
※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1395890649.A.F0D.html
1F：→ grox:methylation? CpG? 还是你要切久(O/N)看看? 03/27 11:54
2F：→ soom:XbaI 是dam methylation sensitive 03/27 11:55
谢谢提点
我的切位序列是
5' 3'
GA
T|CTAGACC
CT
AGATC|TGG
3' 5'
网路上找到的资料是 XbaI前後有GATC就会受甲基化影响
请问甲基化的问题有办法解决吗?
或是换限制性切位会比较快? 谢谢
※ 编辑: bluesnow1122 来自: 140.117.93.237 (03/27 12:37)
3F：推 soom:找dam-的菌株(ex. JM110) 或是设计别的切位都可 03/27 12:51
4F：→ bluesnow1122:谢谢^^ 03/27 13:41
5F：→ roy047:楼上正解~ 没dam就不会甲基化了 plasmid seq不受影响 03/27 13:41