作者USARMY (战斗小鸡)
看板Biotech
标题[求救] q-PCR每一批control的GAPDH量不一样
时间Fri Mar 28 22:28:05 2014
各位大大好
我q-PCR跑出来的GAPDH每一批sample的contrl组所测出来的值都不一样(ex:28,18,31)
但是实验室的人却没有这种问题, 他们说每一批的control组测的值都差不多。
有想过可能是转cDNA的过程出错,但是我一次都是转很多批,
所以那次转的那几批应该也要差不多才对,可是却没有。
定量的机器是Maestrogen nano drop, PCR机器是ROCHE的light cycle 480。
请问有可能是那些地方会影响到GAPDH的差别?
感谢
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1F：推 mesenchymal:1. 只用GAPDH当internal control不一定足够,有时 03/28 22:52
2F：→ mesenchymal:GAPDH表现量仍可被影响,建议再找1个2个其他genes辅助 03/28 22:53
3F：→ mesenchymal:2. 照你写的Ct值(28, 31)似乎远低我印象中GAPDH的ct值 03/28 22:54
4F：→ mesenchymal:不知道你拿多少RNA转cDNA,又拿多少template跑qPCR 03/28 22:55
5F：→ mesenchymal:你似乎要确定你RT有转成功 03/28 22:56
6F：→ mesenchymal:3. nano drop也只是用OD260来测量RNA conc.相对准但 03/28 22:58
7F：→ mesenchymal:不是绝对,不知道你的260/280还有260/230值多少? 03/28 22:59
8F：推 bluesnow1122:cybr green有混均匀吗?(认真) 03/28 22:59
9F：推 mesenchymal:至於其他操作问题,我就不提了,请其他高手补充 03/28 23:01
10F：推 jabari:加一个PTC calibator... 作△△CT 让没次跑的数据跟PTC比Ra 03/29 07:03
11F：→ jabari:tio, 这样就算ref有变动也不会影响实验数据. 用LC480的话 03/29 07:03
12F：→ jabari:直接派就行了 03/29 07:03
13F：→ jabari:记得Calibator最後会设为0..用advance relative 改linear 03/29 07:06
14F：→ jabari:显示 我想你的数据就ok了 03/29 07:06
15F：→ allthebest:多加1-2house keeping gene+1 03/29 13:44
16F：推 allthebest:RNA quality 除了看260280值也可以跑一下胶check 03/29 13:48
17F：→ USARMY:感谢各位指导,internal control会再找找看其他的,因为有关 03/29 16:58
18F：→ USARMY:细胞体积,所以才没用actin等。cybr green是有mix均匀的,因 03/29 16:59
19F：→ USARMY:为我每次跑的同一批GAPDH都会一样,所以我猜测是转cDNA时的 03/29 17:00
20F：→ USARMY:问题。j大的方法我会再研究一下,感谢唷! 03/29 17:02
21F：→ USARMY:感谢a大的建议 03/29 17:12