作者lacampanella (Concerto No.2)
看板Biotech
标题[求救] Western blot的protein似乎卡在well
时间Sun Mar 30 23:03:24 2014
目前正在用SDS-PAGE尝试压185kD左右的蛋白质，
试过很多次，但每一次的结果都是在250kD以上有很淡且形状不规则的band，
而且可以另外看到很深色的band紧邻於well下方。淡band离深色band有一段距离。
然而其他比较小的protein（140以下）情况正常。
抗体的专一性、marker的正确性应该是没问题，
所以这样的情况我怀疑是protein aggregate，或是有multiprotein complex卡在gel下
不去，我查到网路上有些人建议不要煮，会使protein aggregate，但是有人却说煮也
没关系；有人是说煮完要再离心一次，只取上清（但是这样浓度不就变了@@）；有人建
议用DTT；总之，众说纷纭……
不知道各位知不知道什麽方法可以改善这种情况？
谢谢。
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Protocol如下：
1. 1XRIPA（含proteinase inhibitor）萃取protein：组织捣碎之後sonicate（也试过
不sonicate），4度C离心15min，取上清液，测浓度，加入1XRIPA与sample bfr（含
2-ME）配好每一管sample（80-100ug/well）
2. 100度C水煮5min，on ice 2min
3. load in 7%（也试过8%）的gel，60V 30min，然後转90V 1hr30min
4. Transfer（湿式） 75V 4hr到PVDF membrane上
5. Blocking 2hr in 5% TBST-milk 室温
6. 1Ab 1:1000 overnight 4度C
7. TBST wash 10min X3
8. 2Ab 1:1000 1hr 室温
9. TBST wash 5min X4
10. TBS wash 5min X2
11. ECL呈色
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※ 编辑: lacampanella (61.230.126.111), 03/30/2014 23:05:01
※ 编辑: lacampanella (61.230.126.111), 03/30/2014 23:08:41
※ 编辑: lacampanella (61.230.126.111), 03/30/2014 23:10:13
※ 编辑: lacampanella (61.230.126.111), 03/30/2014 23:12:56
※ 编辑: lacampanella (61.230.126.111), 03/30/2014 23:14:51
1F：推 qiet:80-100ug/well, 浓度有需要这麽高吗, 会不会都卡住了啊 03/30 23:16
2F：→ qiet:5-20ug/well应该可以应付大部分的状况, 除非量真的很少 03/30 23:18
3F：→ lacampanella:意思是说浓度太高会卡住？ 03/30 23:30
4F：推 joseph103331:我跑过一个350k的 加bete-mercap就一定压不到 03/31 01:16
那你是用DTT？
5F：→ blence:你跑胶的时间太短dyefront应该才2/3处吧？ 03/31 05:59
已经跑到gel的边缘了
6F：→ blence:至於你的浓度? 你用BCA测吗？? 03/31 06:00
是
※ 编辑: lacampanella (61.230.126.111), 03/31/2014 08:04:32
7F：推 alaric:用rainbow marker, 确定你要的区域有分开, 还要多跑些 03/31 15:48
8F：推 jabari:好吧....你sonicate的probe有磨平吗??? 03/31 18:32