作者Bicuculline (Kie Huang)
看板Biotech
标题[求救] western加完二抗, 结果背景无敌高,全白
时间Thu Apr 3 06:56:54 2014
求救一下
想请问一下各位高手
小弟在做 Western blot
前面一切都很正常
到了加二抗, incubate 一小时後
再放入ECL incubate 两分钟
最後在 imager 下面照照片
问题出现在
ladder 部分,照出来的影像完美无问题
但是, 我的 sample 部分的 membrane 照出来却是全白
整个就像是 background 超级无敌强
强到整张membrane 都是白的
请问一下
这有可能是哪方面出问题?
是二抗浓度太高吗? 我用1:3000
还是二抗哪里有问题?
感恩!
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※ 编辑: Bicuculline (75.108.126.33), 04/03/2014 06:57:35
1F：→ xxtomnyxx:你二抗完该不会没有洗过就加 ECL 吧？ 04/03 09:14
2F：→ Bicuculline:有啦~~我有用TBST洗三次,各10分钟~ 04/03 16:19
3F：推 kdldt:你blocking ok吗?会不会是一抗乱黏?我有做过讯号很低的 04/03 17:18
4F：→ kdldt:整个糊糊的就是表现量很少.另外一抗是poly还是mono脏不脏? 04/03 17:19
5F：→ kdldt:你的一抗overnight还是1.2小时?前者可能因讯号低会脏 04/03 17:21
6F：→ kdldt:ECL也有分强弱.太强的会背景一片黑且讯号易衰退 04/03 17:24
blocking是ＯＫ的
其实我做了两组一模一样的实验
blocking和一抗都是一模一样的流程 (一抗是重复使用的）
所以一抗应该是不会有问题
因为第一组照出来还算乾净漂亮, 只是band讯号没这麽强
才会想再重做一次
但第二组做出来, 二抗incubate 完以後
却整个是全白, 什麽都分辨不出来
ＥＣＬ是同一罐
所以我才会猜测是二抗得问题
但又不知道二抗到底怎膜了....Orz
7F：推 qiet:blocking用什麽阿? 04/04 00:18
5% BSA
8F：推 snow200272:你白光有关掉吗... 04/04 01:27
有阿, 我连ladder是同时间一起照的. ladder很漂亮. 所以跟白光应该是没关系吧
不过我有关
※ 编辑: Bicuculline (165.91.164.114), 04/04/2014 04:38:29
※ 编辑: Bicuculline (165.91.164.114), 04/04/2014 04:39:24
9F：→ money1015:我们实验室二抗大部分都用1：10000说 04/04 15:38
10F：推 snow200272:sample是phospho的吗会不会放太久degrade了如果本来讯 04/04 17:29
11F：→ snow200272:号不强建议提高samples浓度 04/04 17:29