作者kiwishiuan (Shiuan )
看板Biotech
标题[求救] miRNA PCR侦测方法
时间Fri Apr 18 10:20:46 2014
各位前辈好
最近在测试一家ribobio的miRNA primer set
不知道有没有用过他们家产品的前辈们可以给我一些建议
他们家的产品是利用有特异性的loop去转出特定的miRNA，所以是用他们家的RT Primer
，然後RT enzyme哪家都可以，只是有温度要求，要42度下去跑，
其他条件照平常做一般mRNA就可以了
（所以在这边条件下我是用Roche one-step RT enzyme) 温度就设42度60 min
72度10min, 4度3min)
然後Q-pcr的要求就都比照一般mRNA，只是F,R primer就是他们的primer set附得
我的SYBR是ABI的， QPCR机器是ABI 7300, 温度条件照ribobio建议设
(1X)95 20sec
(40X)95°C 10sec, 60°C 20sec, 70°C 10 sec.
(在70度这边因为仪器读取时间10秒读不到，所以我加到30sec)
Add dissociation curve.
Data collection at 70°C.
在以上的条件下，几乎测不到数据，dissociation curve看起来是
一条抖来抖去的下坡...
因为已经买了好几个miRNA的primer set，所以势必是要把方法建立起来了
不然之前实验室试用qiagen的，虽然很贵，但还满好测的ＱＱ
请问有没有用ribobio的前辈们可以指导一下，看是要怎麽改条件会比较好，谢谢
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1F：推 datro:没用过 但是 如果是hairpin loop RT温度可以加个16~25C 04/20 00:39
2F：→ datro:理论上RT hairpin loop本身能match的base 很少 所以要低温 04/20 00:40