※ [本文遭板工误删，在此向young1022板友致歉] 作者: young1022 (183) 看板: Biotech 标题: Fw: [实验]glucose oxidase 相关问题 时间: Mon Apr 21 23:42:16 2014 ※ [本文转录自 Chemistry 看板 #1JLJ7Deg ] 作者: young1022 (183) 看板: Chemistry 标题: [实验]glucose oxidase 相关问题 时间: Mon Apr 21 22:57:15 2014 各位神人您好 在下是个研究生 最近欲使用glucose oxidase氧化葡萄糖产生H2O2 利用自己和成的纳米纤维(具有peroxidase activity)将H2O2分解成自由基 使得氢氧自由基(OH dot)与显色剂TMB反应而显色 目前遇到的困难是 实验不管怎麽做都无法显色 相关实验步骤如下: Solution preparation: 1.Glucose oxidase – 取定量GOD粉体，直接溶於pH5的醋酸缓冲液(1 mg/ml)，直至变为 黄色均匀溶液後，直接放入冷冻库(-18.5 o C)冷冻。 2.Glucose solution – 取定量glucose粉体，溶於DI water中，待完全溶解後直接放入 冷藏(~2 o C) 3. TMB stock solution – 取定量TMB粉体，溶解於DMSO，配置成20mM的stock solition 後，放入冷冻库(-18.5 o C)冷冻。 Procedure: 1. 先将预先配置好的glucose oxidase solution於冰浴中退冰，然後将0.5ml磷酸钠(pH 7)缓冲液及0.1ml葡萄糖溶液加入2ml体积的eppendorf中，待GOD退冰後，取0.1ml再加入 上述的eppendorf中。 2. 将eppendorf用隔水加热方式，於37oC下加热30min(在暗室下操作)。 3. 取3.8ml的醋酸缓冲液(pH 4)及1mg ZnFe2O4粉体，置於事先用铝箔纸包装好的样品瓶 (~20ml的体积大小)内，隔水加热37oC。 4. 待eppendorf内溶液反应时间到，直接加入於上述的样品瓶内，同时再添加0.1ml的 TMB solution，然後反应计时30min。 5. 待反应时间完毕，将样品瓶内溶液取定量体积出来离心沉淀後，取其上层液体，直接 做UV-Vis光谱仪光学量测，量测波长为653nm。 所使用的GOD根据sigma所提供的物质资讯，其比活性为100,000U/g，而之前实验中，我添 加0.1ml的GOD(1mg/ml)，经换算大约为10U。根据sigma定义的1U为: 在pH5.1的醋酸缓冲液，温度为35度时，其每分钟可氧化1μmole的葡萄糖。 实验中所添加的葡萄糖量为: 490mM(初始配好的溶液) x 0.1ml(所添加的量) = 49μ mole 虽然在本实验反应条件为pH7且环境温度为37度，并非pH5.1且35度，但大略计算其活性， 大概可消耗10U x 1μmole/U-min x 30 min = 300 μmole 葡萄糖，也就是相对可产生 300μmole的过氧化氢。 由於实验做不出来，因此我根据上面的理论计算，我直接跳过GOD氧化葡萄糖的过程，直 接添加配置好的H2O2溶液(490mM)。并且将实验步骤稍微更改为: 1.取0.1ml，490mM过氧化氢溶液及0.6ml (0.5 + 0.1，多添加0.1乃是为了使反应浓度可 与之前实验依样，因此多添加了0.1ml，这样可使整个反应体积为0.7ml )磷酸钠缓冲溶液 於eppendorf中。隔水加热30min於37度下。 2.接下来的实验方式都一模一样。 结果利用此种方式可以得到相当明显的显色 根据上面的方式，我还做过49mM以及4.9mM的H2O2 最低浓度也是略有显色 葡萄糖氧化酶才刚买没多久，应该不会出问题 因此很困惑 最原先的实验方式是否有哪里出错了呢? --

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