作者zodiac123 (鸟松吴尊)
看板Biotech
标题[求救] PCR产物与primer设计
时间Wed Apr 23 13:06:13 2014
大家好
事情是这样的
原先有一条cDNA序列(RACE做出的) 而且有一组primer 跑PCR可以夹出一段序列(约120bp)
但用该组primer跑PCR却夹不出gonome DNA (怎麽跑band都在100bp以下....超烦)
我也试过以不同annealing温度夹出120bp片段 但不是杂band一堆 就是只夹出100bp以下
的片段
所以我又另外以cDNA序列设计一组primer 位置大概是原先primer两边扩展30-40bp的地方
想说先以该段primer夹出一段序列(约220bp) 在稀释PCR产物(100倍) 再以巢氏PCR原先的
primer夹出目标序列(120bp) 刚刚试了不同annealing (分别为48,50,52,54,56,58)且使
用後来设计的primer夹出220bp 却又夹不到目标序列(220bp)
想请问大大有没有其他方法可以改善QQ 不懂我到底出了什麽问题?
或许一开始夹出120bp的primer的condition可以改善QQ
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.80.2
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※ 编辑: zodiac123 (140.112.80.2), 04/23/2014 13:08:44
1F：→ vandia:我有没有看错?@@ 你要拿夹cDNA的primer去夹genoimc DNA??? 04/23 13:09
2F：→ vandia:你是认真在问的吗?? 04/23 13:11
3F：→ WinnieDad:intron可能很大一条或N条，或者是你cDNA的primer刚好卡 04/23 13:45
4F：→ WinnieDad:在intron-exon的boundary都可能P不出来。 04/23 13:45
5F：推 hajimels:你cDNA primer要挟gDNA，除非一开始你就设计在exon上 04/23 15:26
6F：→ vandia:用cDNA的primer去夹gDNA,不可能P出你要的120跟220吧.. 04/23 21:27
7F：→ vandia:你说後来设计的夹到220有送定序确认是你要的吗? 04/23 21:27
8F：→ zodiac123:cDNA没有intron 所以primer会设计在exon上 04/23 23:05
9F：→ zodiac123:每次p出来都只有小於120bp的band 照理讲应该要等於或者 04/23 23:06
10F：→ zodiac123:大於 有可能primer卡在 intron-exon的地方 感谢大大QQ 04/23 23:06
11F：→ zodiac123:To V大 因为band的bp数都是小於原先预设的 所以没送 04/23 23:08
12F：→ zodiac123:照理讲应该要大於或等於阿~~~~好苦恼 04/23 23:09
13F：→ blence:你是真的讲cDNA没有intron？还是要讲primer没有跨intron？ 04/23 23:34
14F：推 mesenchymal:本文跟推文一起看看不懂,所以你primer设计到底有没有 04/24 01:47
15F：→ mesenchymal:跨intron? 04/24 01:47
16F：→ xxtomnyxx:小於 100 bp 我认为是 primer dimer 比较有可能 04/24 08:54
17F：→ zodiac123:不太知道有没有跨到intron... 04/24 09:40