作者gugu283 (gugu283)
看板Biotech
标题[求救] phalloidin staining
时间Sat Apr 26 00:30:11 2014
请问有关phalloidin的萤光染色实验~
我想观察F-actin的polymerization
使用Acti-stain 488的phalloidin 细胞为MDA-MB-231
制作sample过程如下:
3.7%formaldehyde fix 10 min
warm PBS wash
0.5% triton 5min
PBS wash
100 nM phalloidin 30min
PBS wash X3
100 nM DAPI 1min
wash
seal
但是在萤光显微镜下观察
细胞形状都烂烂的 很多毛边 甚至呈萎缩状
没办法看到一束一束的F-actin 而是整颗细胞都绿色的 而且细胞内感觉染到很多颗粒
请问有什麽方法可以改善细胞形状的问题?
整颗细胞的绿色是可能为non-specific binding吗?
(我已试过phalloidin内加1% BSA，或染之前先以1% BSA bloking 30min )
感激不尽!!
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1F：→ snow200272:FA也要warm!!! or try methanol fix 04/26 00:40
2F：推 tchan:triton X-100 只要0.1%就够了 & DAPI看起来如何？有可能不是 04/26 11:14
3F：→ tchan:染色过程出问题，而是细胞本身状态就不好 04/26 11:14
4F：→ gugu283:DAPI染起来OK, 我会试试看warm FA, 但是methanol似乎会破 04/26 13:11
5F：→ gugu283:坏actin?那我triton 也改成0.1%试试看；细胞本身是还好虽 04/26 13:13
6F：→ gugu283:然没有很漂亮 但我固定完跟triton处理完在显微镜看 都没有 04/26 13:14
7F：→ gugu283:像染完以後萎缩得那麽厉害 毛边也没有那麽多@@ 04/26 13:15
8F：→ gugu283:我用90%甘油封片会有影响吗? 04/26 15:15
9F：→ snow200272:如果DAPI没问题~应该就是DAPI以前步骤的关系 04/27 20:59
10F：推 oplz:不要乱教.. phalloidin 不会认 methanol fixed actin fiber 04/28 06:59
11F：→ oplz:PFA or FA 温的冷的都没差 04/28 07:00
12F：→ captdavince:请问有人有经验应该cold去固定还是warm固定比较好呢? 04/28 19:22
13F：→ gugu283:请问有人用过这只phalloidin吗?不知道有没有人试过浓度? 04/30 11:34
14F：→ gugu283:我有试过更高浓度但还是整颗细胞都绿色，看不太到fiber 04/30 11:36
15F：→ gugu283:我也试过染时放37度C 但还是整棵绿 小妹都要崩溃了T^T 04/30 11:38
16F：推 tchan:哪只pholloidin?? 我常用的是invitrogen的A12379 05/01 17:37
17F：→ tchan:跟你的步骤差不太多，只是pholloidin染色时放37度C 05/01 17:38
18F：→ tchan:然後依照细胞不同调整所需pholloidin的量，选一个最好的 05/01 17:38
19F：→ tchan:我是用warm&fresh prepared 4 %PFA。Triton 则是用0.1% 05/01 17:40
20F：→ tchan:之前我用0.5%的trixton时也印象中是整颗绿，没有fiber 05/01 17:41
21F：推 jabari:会是PBS/PBS"T"的问题吗? tween20可以维持triton开的孔洞 05/01 18:21
22F：→ snow200272:不知道跟cell type有没有关系~有没有其他细胞可以当con 05/02 12:48
23F：→ snow200272:tol呢 05/02 12:48
24F：→ gugu283:我调整了之後还是染不太到fiber欸...而且细胞形状一直很烂 05/03 21:22
25F：→ gugu283:FA和PFA固定有差吗?还是不是专门用来培养细胞的玻片会有差 05/03 22:11
26F：→ gugu283:我是没有看过有人用PBST耶@@ 05/03 22:11
27F：→ gugu283:我用的是cytoskeleton的Acti-stain 488 拜托高手解救T^T 05/03 22:12
28F：→ tchan:data sheet用的细胞是3T3，看看是否要拿来当control 05/04 01:13
29F：→ tchan:或者我本身经验是WI-38以及A549都可以非常容易染到Fiber 05/04 01:14
30F：→ tchan:找些positive control确认你的所有材料都没问题吧!! 05/04 01:14
31F：推 frank22004:我们全都在室温下 05/25 13:11
32F：→ yinshuang:你的phalloidin接的是绿色萤光，细胞当然是绿色的.... 07/21 16:03
33F：→ yinshuang:降低phalloidin的浓度或wash久一点，应该会出现你要的。 07/21 16:05