作者yesdora (简单生活)
看板Biotech
标题[求救] sigma MTT assay kit的溶解液
时间Tue May 20 12:35:53 2014
版上各位先进大家好
我要观察药物对癌细胞的生存率影响，参考了论文购入了sigma的MTT assay kit
kit里附的溶解液是0.1N HCL in anhydrous isopropanol
我的实验过程如下：
细胞在96well里培养24小时後添加药物(高浓度溶解於DMSO，最终以medium稀释成1/1000)
药物添加後培养72小时
加入1/10量的MTT solution再培养4小时
上清液吸掉，加入等量的mtt溶解液，pipetting。
我的问题是我最後加入溶解液後只有加入的瞬间有紫色产生
然後就淡掉变成浅黄色，我拿去振荡(没差)
或是再放回恒温箱里一晚也都没变色(还乾掉>"<)，显微镜看细胞也没溶掉。
请问是哪个步验不对了呢？
请救救我。
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1F：→ snow200272:试试看处理完药品以後有用PBS wash过吗 05/20 21:25
没有耶，请问是在哪个步骤要wash呢？
2F：推 sean0912:之前我做MTT 加入含MTT之medium培养後 细胞会呈明显紫色 05/20 23:44
3F：→ sean0912:加上产生之formazan通常是不溶於水相 05/20 23:45
4F：→ sean0912:所以没产生有可能是细胞已经死亡 05/20 23:46
但我用显微镜观察时确定控制组是正常的，但全盘都没有变色…
5F：→ blence:挑一下语病,"加入1/10量的MTT solution"是未以medium稀释？ 05/21 02:06
抱歉我没讲清楚，是加培养液的1/10量，100ul加入10ul後pipetting
6F：→ blence:浅黄色就是MTT未作用的颜色,如果你是正常使用,不需去上清液 05/21 02:10
7F：→ blence:就看到发紫了,就算有phenol red也可以观察到,不必等溶解液 05/21 02:15
因为我的细胞是附着细胞，我看protocol写说要吸取再加，所以不吸取也可以吗？
8F：→ blence:不过最有问题的是放到incubator会乾掉,如果96wel细胞没乾掉 05/21 02:18
9F：→ blence:这一盘放进去会乾掉,是体积太少还是溶解液真的容易挥发？ 05/21 02:20
我各well是100ul，药剂添加10~20ul，放隔天是真的挥发乾掉@@
另外我有查到其他的protocol写到最後加DMSO，不晓得这和isopropanol的差别是？
我不知道行不行但我下次用DMSO试试…也谢谢大家的意见
※ 编辑: yesdora (133.1.59.65), 05/21/2014 15:59:14
10F：→ skyoes:应该是isopropanol的问题，因为MTT是氧化还原效应 05/23 22:06
11F：→ skyoes:醇类会和mtt进行氧化还原作用，DMSO只会溶解不会进行反应 05/23 22:09