作者dirkwen (kevin)
看板Biotech
标题[求救] qRT-PCR基因表现问题
时间Thu May 22 10:13:21 2014
各位版友
小弟我是用qRT-PCR作相对定量的基因表现
做了A、B、C三个targeted gnen与用18s rRNA作Internal control。
以下有几个问题
(1)因为老师只希望每个基因作一重复
所以有先请我挑选五个不同的SAMPLE作二重复在不同天做
然後要去看批间与批内的变异情形(inter-assay and intra-assay variability)
想请问我要怎样算才是比较正确的?以个人看?还是以基因看?
http://ppt.cc/VRE8
http://ppt.cc/62Pc
绿色的部分为每个基因所有SAMPLE二重复的MEAN SD CV
红色的部分为每个SMAPLE二重复的MEAN SD CV
最後橘底的为那一盘上所有基因每个SAMPLE的MEAN SD CV
不太知道哪个是对的?还是全错了...?
(2)因为是做相对定量要用2^-△△Ct作分析
但是我的实验只有一个时间点且都是CASE没有CONTROL
只能算出各个SAMPLE的每个基因的△Ct(A、B、C基因CT-18S CT)
没有一个原始点可以算△△Ct，所以我之後可以直接用每个基因△Ct直接做分析吗?
还是也可以用2^-△△Ct作分析△△Ct这部分就带入△Ct那样?
麻烦有经验的大大解惑了! 谢谢!!!
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1F：推 as862437:想问一下(1)批间的话是同样的DNA在不同天跑吗? 还是说实 05/25 00:46
2F：→ as862437:验的天数不同? 批内的话是要比表达量吧! 05/25 00:47
3F：推 as862437:如果是要比较A.B.C 基因在五个 sample 中的表达，把两次 05/25 00:53
4F：→ as862437:当成biological repeat的话 就是红色那个 05/25 00:54
5F：→ as862437:绿色的话是在比较 基因ABC之间的相关性 05/25 00:54
6F：→ dirkwen:谢谢A大解说，批间是指同样cDNA不同天跑 05/26 23:36
7F：→ dirkwen:老师当时还有请我算每个人不同天各基因四个点算MEAN&SD 05/26 23:38
8F：→ dirkwen:之後算出一个CV，然後看一看说好，我不太了解 05/26 23:39
9F：→ dirkwen:那是要看这个人在这个基因做不同天共两次两重复的变异吗? 05/26 23:40
10F：→ as862437:就我的理解，你的不同天只是操作上的变异跟生物性质无关 05/27 14:00
11F：→ as862437:所以我会解读成同样的sample (人) A.B.C基因 做4重复(2*2 05/27 14:01
12F：→ as862437:不同天用来检测你的数据稳定度 05/27 14:02
13F：→ dirkwen:谢谢A大的解说，有比较了解了:) 06/02 23:40