作者IDIDyan (我)
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标题[求救] 如何确认长片段tandem repeat的数目
时间Mon May 26 23:47:34 2014
最近碰到的棘手问题恳请各位帮忙~~
目标是 MUC4，这个 gene的 exon 2 主要是由连续的tandem repeat(48bp/TR)组成
之前文献指出每个人的这段序列长度相差很大 (7k~19k都有)
我想知道的是""我们的病人和其他正常人的这段TR数目是否有差别""
由於检体量不多没办法做southern blot
之前尝试用Long PCR的方式把整段TR P出来，可惜没有band
PCR condition 如下
TaKaRa LA Taq (5 units/μl) 0.5 μl
10X LA PCR Buffer ll (Mg2+free) 5 μl
25 mM MgCl2 (final 2.5 mM) 5 μl
dNTP Mixture (final 400 μM each) 8 μl
Template 500 ng
Primer 1 1.0 μM (final conc.)
Primer 2 1.0 μM (final conc.)
ddH2O to 50 μl
92°C 2 min
↓
92°C 10 sec------
55°C 30 sec 10 cycles
68°C 15 min------
↓
98°C 10 sec---------------------
55°C 30 sec 20 cycles
68°C 15 min + 15 sec/cycle------
↓
68°C 7 min
不知道能怎麽调整，或是有其他方法确认TR数目
请大家帮帮忙!拜托了!!
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1F：推 ljii:P不出来的是病人sample吗? 有没有试过用最短的repeat数 05/28 13:46
2F：→ ljii:当positive control, 至少确定primer可用? 05/28 13:47
3F：→ ljii:另外, tandem repeat的PCR本来就很困难, 有时连短短1kb都很难 05/28 13:47
4F：→ ljii:P, 何况你这是long PCR. 有没有可能不要用long PCR硬干? 05/28 13:48
5F：→ ljii:例如digest後跑胶看size? 检体量不足不能作western但够digest 05/28 13:50
6F：→ ljii:吗? 05/28 13:50
7F：→ IDIDyan:我现在是先用正常人和cell line的sample先试 05/28 14:05
8F：→ IDIDyan:由於无法确定每个人的repeat次数所以也不知道谁最短... 05/28 14:05
9F：→ IDIDyan:请问lj大先切看size的意思是什麽呢?我有试过用RE先把其他 05/28 14:07
10F：→ IDIDyan:可能的nonspecific target切掉再PCR可惜还是没有 05/28 14:08
11F：→ IDIDyan:我也想知道有没有其他步要用硬干的方式哈哈.... 05/28 14:08
12F：→ Ianthegood:用phusion看看 05/28 16:03
13F：→ IDIDyan:之前有问过phusion polymerase，最多能做到16k，可是文献 05/28 16:15
14F：→ IDIDyan:上写这范围可能有7k~20k... 05/28 16:15
15F：推 jabari:南方点墨法QwQ 我家某TRmut小鼠这样genotype 05/28 16:16
16F：→ IDIDyan:检体DNA没那麽多啊ˊˋ 05/28 16:36
17F：推 ljii:我有点误解你的意思了, 你的sample是genomic DNA, 所以我的 05/30 06:21
18F：→ ljii:结论是最好的选择是作southern. 你的probe可以选择去anneal 05/30 06:22
19F：→ ljii:那段repeat, 因为你的repeat很多, 所以signal会超级亮. 所以 05/30 06:22
20F：→ ljii:你需要的genomic DNA量就不用那麽大, 1ug应该就够了, 甚至更 05/30 06:23
21F：→ ljii:少都可能可以. 这跟detect single copy gene的southern动辄 05/30 06:23
22F：→ ljii:要好几十ug的genomic DNA是不一样的. 05/30 06:23
23F：→ ljii:另外Phusion对long PCR我觉得并不太优, 最强大的还是takara 05/30 06:24
24F：→ ljii:LA, 但是takara的proofreading感觉上没有phusion佳.不过你没 05/30 06:25
25F：→ ljii:差, 不需要非high fidelity不可. 05/30 06:25
26F：推 ljii:另外文献里有人有long PCR的protocol吗? 还是你是自己设计 05/30 06:28
27F：→ ljii:primer在抓条件? 05/30 06:29
28F：推 jabari:同意ljii...TR用传统南方是可行的..只是要买大胶台XD 05/30 13:39
29F：→ jabari:BTW 我家小鼠取尾巴gDNA...量其实很少 但也可以作 05/30 13:40
30F：推 jabari:或是原PO试试用random primer跑Long PCR再作南方试试..说 05/30 13:42
31F：→ jabari:不定是可行的方法??(累一点而已) 05/30 13:42
32F：→ IDIDyan:这麽想想似乎southern真的可行，感谢两位! 05/30 14:54
33F：→ IDIDyan:另外Long PCR 我是参考各厂商的condition自己调整的 05/30 14:55
34F：推 ljii:嗯, 如果用厂商给的protocol, 遇到tandem repeat PCR, 往往 05/31 14:20
35F：→ ljii:就会遇到地雷. 我举自身实例, 我研究的是某个triple nucleoti 05/31 14:21
36F：→ ljii:nucleotide repeat 疾病. 我们研究的这个病, 如果要PCR包含 05/31 14:22
37F：→ ljii:那段repeat的区域, 传统Taq是死都p不出来的,即使片段只有1kb 05/31 14:23
38F：→ ljii:这个field用来PCR这段就是有固定的primer及polymerase, 大家 05/31 14:24
39F：→ ljii:都只用那几种.改用别家的polymerase几乎不可能work 05/31 14:25
40F：→ IDIDyan:我看到前人对我这段repeat都是做southern 05/31 23:04
41F：→ IDIDyan:所以PCR condition只能自己试 qq 05/31 23:04