最近新手上路 lentivirus transfection 做 iPS 接到的第一个任务是准备 packing 用的载体 psPAX2 和 pMD2.G https://www.addgene.org/mammalianrnai/Packaging/ 2nd generation system deposited by the Trono lab 实验室的学妹之前纯化这两个载体， 是从 -80 glycerol cell stock (stbl3 strain) 养小量 0.5 mL 半天， 然後傍晚放大到 200 mL overnight 到隔天， 用 Qiagen 的 Hispeed midiprep 纯化， 最後分别得到 ~25 和 100 ug 的载体。 远远不够接下来的实验需要。 (实验室用的比例是 15 ug psPAX2 + 5 ug pMD2.G + 30 ug pLOVE-gene into 1 plate 至少要 8 个 plate) 我怀疑是 glycerol cell stock 不行了， 所以新 transform 的 colony 养小量然後放大成 400 mL， 隔天把 400 mL 的 culture 分成两部分， 其中的 5 mL 用 Qiagen 的 Miniprep 抽成 50 uL plasmid； 剩下的用 Hispeed midiprep 纯化成 1 mL。 结果 5 mL 分别抽出 ~100 ug 和 ~37 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G 但是 midi 只抽出 ~23.5 ug和 ~95 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G (定量都是用 nanodrop) Miniprep 的 column 理论上是 20 ug 的 binding capacity， 而 hispeed 是 200 ug。 不管怎麽算都很觉得有点奇怪。 三天後，我用新转的 colony 重新养小量 30 mL， 用 miniprep 重抽一次 (分成 6 管)， 结果分别得到 ~20 ug 和 ~50 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G 到这里，实在卡关了， Addgene 上面说这个载体是 high copy， 根据 QIAGEN 的说法，理论上会有 3-5 ug DNA/ml LB culture。 看看自己这几次的操作， 只有新鲜 transform 的那天的 5 mL 抽出理想的量， 其他都远低於理论产量。 请问版上的大家， 我该怎麽改善我的步骤才能得到合理量的载体? 先谢过大家 m(_ _)m --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 134.84.54.178 ※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1401829665.A.04C.html