作者lidon00968 (满满的希望!!)
看板Biotech
标题[求救] 关於SDS-PAGE
时间Mon Jun 9 13:43:53 2014
如题，最近实验室跑SDS-PAGE出现重大的问题
附上图片
http://ppt.cc/nd-s
http://ppt.cc/Y0yS
这个是跑完退染之後的照片，不知道为什麽在100kDa的附近会有一条不明条带
通过该条条带的band就会像图片上所显示变得歪七扭八
我们家使用的SDS-PAGE 上层胶5%，下层胶是10%
使用的电压为100V、120min
机器上显示的电流大约为20~40mA之间
也有试过定在15mA下去跑，状况依旧
使用的PH值为6.8和8.8，药品都是最近新鲜配制的，
不管是Tris-base(HCl调制到所选PH值)，还是电泳的buffer
APS也是新鲜配制，TEMED是新分装出来的，实验室都放在4度C冰箱保存
Acrylamide我家使用的好像比较特别，是30%的那一种
不过也跟别人家的实验室借过40%的来使用，情况还是一样
sample buffer也是最近才配置，含有2-ME的那种版本
我已经抓问题抓到不知道还有甚麽东西出问题会造成这样的现象!
上图都是使用的ATTO的系统所跑出来的胶图
附上使用Bio-Rad跑的胶图
http://ppt.cc/3BP4
使用的蛋白来源是组织经由超音波震荡萃取出来
浓度大约为30ug左右吧(没有经过确实定量因为是测试所以就随意抓一下!
这现象最近一个月才出现，完全不知道是为什麽?
想请问版上的各位，有人遇过和我一样的情况吗?有甚麽解决办法!
还是有甚麽东西是我没有注意到的，谢谢大家!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.130.98.85
※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1402292635.A.491.html
※ 编辑: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 13:51:15
1F：推 laurel007:推测是配下胶时没压好 06/09 15:20
2F：→ laurel007:不然就是stacking时用更小的电压去跑,用60~80V 06/09 15:22
3F：→ hodala09:将pH6.8的buffer，通过0.22um过滤後再使用。 06/09 15:44
关於过滤一点，我会立刻尝试看看，非常感谢!
补上绿色箭头以上代表就是上层胶体的部分，这几次我都有特地保留上层胶染色
http://ppt.cc/8sto
做下层胶做完的时候我都是用70%酒精下去压
倒掉酒精的时候可以看出下层胶很平，也看不到那条诡异的线
但是跑完胶之後其实隐约就可以到到那条怪怪的东西跑出来，染完色更明显就是!
※ 编辑: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 16:02:00
4F：→ blence:在marker那条,第1,2次有出现,第3次没有,是补PSB的差异？ 06/09 17:15
5F：→ lidon00968:请问PSB是甚麽东西? 是系统不同 分别是ATTO和Bio-Rad 06/09 17:47
6F：→ lidon00968:我家sample的处理都是样品+水+sample buffer 06/09 17:48
7F：→ lidon00968:不过蛋白萃取的方式是取0.5mg组织+500ul PBS进行超音波 06/09 17:48
8F：→ lidon00968:样品配好後会100度煮10分钟 然後才进行跑胶 06/09 17:53
※ 编辑: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 21:54:00
9F：→ jsi:有个疑问pH6.8的buffer，通过0.22um过滤後pH值不会上升吗? 06/09 23:36
10F：→ lidon00968:好奇为什麽会上升? 理论是?? 今天我又再配制一次药品 06/09 23:45
11F：→ lidon00968:明天再来测试看看状况是否有改善! 06/09 23:45
12F：→ blence:protein sample buffer;你的marker那条,只有第三次没出现 06/10 00:04
13F：→ blence:请从PSB确认最後浓度至少有1X,以及8.8与6.8是从Tris base配 06/10 00:33
14F：→ blence:起,至於6.8先过滤或调降电压,除非你们只想先看到data,不然 06/10 00:34
15F：→ blence:这两种不是一般实验室操作必要的条件,显然也不会是问题所在 06/10 00:36
非常感谢，今天已经全部再重新配制所有会用到的药品
从tris-8.8和6.8、sample buffer、running buffer都重新配置
6.8和8.8也都有作过滤的动作，明天会再试试看是否有改善
再次谢谢大家!
※ 编辑: lidon00968 (36.237.212.42), 06/10/2014 01:00:29
16F：推 leptoneta:感觉是下胶还没完全凝固就加上胶 06/10 11:53
17F：→ lidon00968:我很确定我下胶凝固後，才吸掉酒精，确定是平的 06/10 19:09
18F：→ lidon00968:才加入上层胶溶液做上层胶 06/10 19:09
19F：推 IDIDyan:感觉是下胶浓度不均匀，前两张图都有一半的lane跑得颇歪 06/10 20:16
20F：→ IDIDyan:做胶时混匀後再加，另外也有可能是机器老旧而电流过高 06/10 20:17
21F：→ IDIDyan:试着条低电压跑或在低温跑看看 06/10 20:18
22F：→ lidon00968:了解，非常感谢!! 如果要换机器，老板可能会崩溃XD 06/10 20:49
23F：→ IceDR:你有没有重配10% SDS? 06/11 06:03
24F：→ IceDR:或是RUNNING BUFFER的SDS浓度太低 之前实验室发生过类似情况 06/11 06:05
礼拜一重新配制药品後，总算恢复正常!
非常感谢版友们的协助!!
推测应该是那罐快10年SDS坏了，所有会使用到SDS的溶液全部都使用新的SDS配制
现在都很正常!
附上一张现在的胶图
http://ppt.cc/2A-2
非常感谢大家!
※ 编辑: lidon00968 (140.130.98.85), 06/11/2014 13:14:14
25F：推 puec2:哇，SDS会坏喔，这真的没遇过。 06/12 15:31
26F：→ puec2:上了一课。 06/12 15:31
27F：→ hodala09:而且是在第十年才坏，前9年还是好的？ 06/13 22:09
28F：→ lidon00968:不知道.. 东西全部都测试过了 直到换了SDS才好 06/19 16:22
29F：→ IceDR:我在不同实验室遇过两次这种怪胶 都是RUNNING BUFFER出事 08/02 02:54
30F：→ IceDR:一次是有配RUNNING BUFFER STOCK没加10% SDS 08/02 02:55
31F：→ IceDR:然後对稀释完的RUNNING BUFFER补对应的10%SDS就OK 08/02 02:56
32F：→ IceDR:第二次是有人稀释STOCK手残忘了加STOCK 我要求重配也没人信 08/02 02:57
33F：→ IceDR:然後有问题的RUNNING BUFFER一用完 稀释新的一瓶就回复正常 08/02 02:58