※ 引述《kuochuwon (黑轮桑~ YO)》之铭言： : 各位版友好,想请问有关promoter prediction的问题 : 爬过版上许多和promoter有关的文和相关paper : 都无法顺利解决我的疑问 : 最近教授给我一个工作,是要从zebrafish genome中找出sox2的promoter sequence : 再将这些sequence後面加上GFP送入zebrafish embryo表现 : 目前我从NCBI取得zebrafish sox2 gene full sequence後 : 推测promoter应在转录起始点ATG前面数kb的区段 不针对 sox2 基因的话， 其实这样找有可能会有问题， 因为 NCBI 上的 gene 列出的序列是 mRNA 的序列， 如果从 ATG 往前推， 如果遇到 5' Untranslated region (5' UTR) 就有好几 kb 的基因， 有可能你抓到的序列都还是在 Transcription start site (TSS) 後面， 然而 promoter region 应该是在 TSS 附近才对。 : 我的问题是 : 1.目前我的作法都正确吗(也才做一步 冏) : 2.我该如何证明我复制出来的sequence就是我要的sox2 promoter sequence呢 : 或是该进行何种实验,用何种理论说服 : 因为学长质疑就算我复制出来,然後打入斑马鱼细胞也有萤光 : 我要怎样证明它不是其他基因的产物 我之前做类似实验的时候， 得到的观念是对一个 gene 的调控来说， Enhancer 可能比 promoter region 还要重要， 而 Enhancer 可能位於 TSS 前或是後数 kb 的位置， 当然也有可能在 5' UTR 甚至 3' UTR 上， 所以要完美的把调控一个基因表现的所有序列都 clone 起来是很难的， 顶多是假设 clone 的序列占有调控这个基因能力的大部份。 然後验证你的 promoter/enhancer 序列是否正确的方法非常繁琐， 首先就是你提到的萤光， 可以找会表现 sox2 和不会表现 sox2 的细胞株， 把你的 clone 送进去看表现的情形。 然後是更进一步的验证， 去 clone 调控 sox2 的上游基因， 在会表现 sox2 的细胞 (甚至是活体) 中送进你 clone 的 sox2-GFP vector， 并同时在不同组别中 overexpress 或 knock-down 这些调控 sox2 的上游基因， 从是否 overexpress 会促进 sox2 表现的基因时 GFP 有增强等结果， 去判断你 clone 的 promoter/enhancer 序列是否能代表 sox2 的表现。 当然以上那是当你要去 clone 一个没有 reference 的基因的 promoter 的作法， sox2 听起来很耳熟一定很多人做过， 最快的方法当然就是去找 sox2 promoter 的文献， 文献里大多都已经有验证过 promoter region 的功能， 基本上也应该会有提供序列， 学长或老板有意见就拿那篇 reference 给他们看， 出错了就只好去向那篇文献所属的实验室和杂志投诉了...... 补充： 如果要求的物种没有办法找到相关的文献， 但是其他常见物种有相关文献， 那麽也可以从这些物种(如：Human 或 Mus)的文献中指出的 sox2 promoter 序列， 利用 NCBI 的 Blast 功能去找 Zebrafish 的染色体上有无接近的序列， 如果找到的序列也是位於 sox2 附近， 就可以假设这段相似的序列可能为 Zebrafish sox2 的 promoter region， 因为在演化上相同基因的序列在 enhancer、promoter、mRNA 上应该是相似的。 有错还请指正。 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 42.76.97.161 ※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1404039347.A.C46.html 对耶...... 因为我之前是做老鼠， 所以文献很多， Zebrafish 的确不止文献少， 也没有合适的 cell line 可以验证表现强度...... ※ 编辑: xxtomnyxx (42.76.97.161), 06/29/2014 19:29:36 我不太清楚你是怎麽比对序列的， 但是如果我的理解没错， 我不会拿已证明的 mouse promoter 序列去跟 rat 和 human 的「上游序列」比对， 我会直接在 NCBI 的 BLAST 中选择 rat 或 human， 然後拿那段序列去做 BLAST， 找整个 rat 或 human 的序列中与这段 mouse promoter 最相似的序列。 我曾经做过一个案例， 某基因在一个物种 A 以 TSS 为准 -1000 ~ +1 的序列， 在另一个物种 B 上这段序列却是在 TSS 为准 -4000 ~ -3000 的位置， 但是那段序列相似度非常高， 而两种物种该基因的一大差别是 A 的 mRNA 有一段 2 kb 左右的 intron， 而後者没有。 图解： 物种 A TSS ┌→ DNA －┼－－－－┼－－－－┼－－－－┼－－－－→ RNA ＝…………………………＝＝＝＝→ ↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑ ｜｜｜｜｜ ＤＮＡ序列高度相似 ｜｜｜｜｜｜ ↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓ 物种 B TSS ┌→ DNA －┼－－－－┼－－－－┼－－－－┼－－－－→ RNA ＝＝＝＝→ ＝ Exon … Intron 这种情况下， Enhancer 的序列有可能是在物种 A 的 TSS 前， 也有可能是在物种 A 的那段 intron 中， 因为我这个案例的基因并没有 promoter 序列的相关文献， 所以真的要测试就要两段序列都拿来测， 当时我手上还有其他有文献的基因的 promoter 要做， 所以这个案例就被我放置了 XD 呃....扯远了， 总之我要说的是， 不要把 promoter 序列限定在 TSS 上游的固定范围内， 有些 paper 证明的 promoter 可能同时包含 promoter 和 enhancer， Enhancer 的位置不像 promoter 是固定在 TSS 附近， 有可能会在离 TSS 很远的位置， 所以要从整个 DNA 的序列中去做 BLAST， 通常只会跑出一个高度相似的结果， 那个结果就应该会是你要的 promoter 序列了。 然後， 我随便拿了 mouse hoxb9 的 上游 350 bp 的序列 去跟 human 还有你的 Chinese hamster 做 BLAST， Human 有找到整个序列 350 bp 都有 91% 的辨识度的序列， 位置也是在 human 的 HOXB9 附近， Chinese hamster 则只有 200 bp 左右的序列有相符， 但是那 200 bp 序列的辨识率也有 98%， 我想 Chinese hamster 的 genomic DNA 应该还没完成定序吧？ 少掉的那 150 bp 大概是因为没有资料所以没办法比对。 有错还请指正 ※ 编辑: xxtomnyxx (42.70.58.194), 07/12/2014 23:51:18