作者o6053309 (Olivia)
看板Biotech
标题[求救] 关於gel filtration 的UV图谱问题
时间Sun Jul 13 16:54:05 2014
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
请教各位大大
目前我纯化的蛋白是Bacillus的sigma蛋白 (总共养4L菌液)
破菌後是存在 inclusion body (破菌後有去跑胶确认蛋白的确有被大量表现)
我大量表现破菌後
以6M Gu-HCl denature 然後再refolding
以40% 硫胺沉淀 离心後取pellet(上清液有经SDS-PAGE跑交确认无蛋白)
最後用FPLC跑superdex 200
总共有1根peak 於是我蒐集那根peak对应的sample 去跑SDS-PAGE
但是居然没有跑出蛋白
我想请问 是没有分离成功吗?
如果没有成功 为什麽又会跑出那根peak?
我有留一些injection的sample去跑胶确认 要injection的sample的确存在我的蛋白
找不出为何我的蛋白消失了 QQ
想请问各位 拜托了
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1F：推 YONGGI:会不会是蛋白质浓度太低? SDS-PAGE使用的染剂不够灵敏导致 07/13 17:08
2F：→ YONGGI:无法看到band.. 跑gel filtration会使蛋白质分散在不同管 07/13 17:09
3F：→ YONGGI:过程中也会有一些损失掉，看你有没有把那几管浓缩後跑，如 07/13 17:10
4F：→ YONGGI:果分开跑，peak又很低，这样看不到band的情形是有可能的 07/13 17:11
5F：→ o6053309:我有先用20%TCA沉淀 在去跑胶 结果....... 07/13 17:15
6F：→ o6053309:那这样是不是没救了 只能重头开始 07/13 17:17
7F：推 rasaze:tca沈淀?那很有可能是没有回溶 07/13 18:05
8F：→ o6053309:我总共蒐集30管 确定每一根都有回溶 加入SAB之後几乎 07/13 18:24
9F：→ o6053309:马上都溶了 07/13 18:25
10F：→ supray:破菌後全蛋白 过gel filtration只有1根peak也怪怪的 07/13 23:21
11F：→ supray:或许那根是某表现量很大的housekeeping gene吧 07/13 23:22
12F：→ supray:或许每个fraction都该浓缩後跑SDS-PAGE确认 07/13 23:25
13F：推 dehydrogenas:你PAGE用甚麽染色? 07/22 14:45