作者silverberry (平行线上的交集....)
看板Biotech
标题[求救] Lentivirus titer 测定
时间Sat Jul 19 15:38:51 2014
大家好，我是 lentivirus 的新手，
想请问版上操作 lentivirus infection 的版大们，
有无推荐的 kit 或是方法测定 lentivirus 的 titer?
在网路上查到很多家不同的 ELISA p24 antigen kit 和不用抽 RNA 可以快速做 qPCR
LTR region 的 kit。
或是用 GFP 类的 reporter 测定 transduction efficiency
也查到 paper 比较分别测定 DNA、RNA 和 protein 量来估计 titer 的方法 (ref. 1)
选择太多了，不知道哪一个比较适合。
挑几种买来试试看这种想法应该会直接被碾出实验室 Orz
我是在化工系的实验室，
实验室之前的助理是用体积记录感染的用量，
结果推算出了转染率 <0.001% 的实验记录。
虽然我看了版上之前的讨论文，了解 lentivirus packaging 和 vector size 成反比。
但是用体积来计算实在让人很崩溃啊 @ @
和指导教授讨论以後希望可以精确地用 MOI 之类的数量化方式来继续这个实验。
所以想知道大家平常都是怎麽数量化这个步骤的。
谢谢大家。
ref. 1
http://www.nature.com/gt/journal/v9/n17/full/3301731a.html
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我们用的 lentivirus vector 是 addgene 的
FUW-OSKM 和 pLOVE 系列，
用 psPAX2 + pMD2.G 在 HEK293FT cell 用 lipo2000 packaging.
Packaging 完收的 medium 用 Amicon 100kD 浓缩後，分装保存在 -80.
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 75.72.204.238
※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1405755537.A.E56.html
※ 编辑: silverberry (75.72.204.238), 07/19/2014 15:41:33
1F：→ shelix:SBI有QPCR KIT...可是夭寿贵 07/19 18:08
2F：→ soom:lab之前是eGFP virus感染293t，推测该批病毒的活性 07/20 01:09
3F：→ soom:不过这种做法当然耗时，也只敢相信10的几次方这样的scale 07/20 01:11
4F：→ soom:好处是能知道"活病毒"的量，而不是死活都一起测 07/20 01:13
5F：推 roy047:类似二楼 取少量virus感染少量cell看GFP，也有lab是跑qPCR 07/20 06:21
6F：→ silverberry:感谢楼上，所以如果 vector 没有 GFP 就要自己做一个 07/21 00:54
7F：→ silverberry:来当 titer 测定的依据的意思? 07/21 00:55
8F：→ silverberry:感谢大家的建议 07/21 00:55
9F：推 liuse:你的vector有带任何antibiotics嘛? 07/21 04:56
10F：→ liuse:有的话 用96-well plate seed series cell density 07/21 04:56
11F：→ liuse:横向加四种不同的virus量，感染後加药，让没infect的细胞死 07/21 04:58
12F：→ liuse:亡，之後数每个well剩多少细胞，划出curve就可以算出titer了 07/21 04:59
13F：→ liuse:不过对不同种类的细胞会不一样就是 07/21 05:00
14F：→ roy047:如果原本没GFP加了GFP表现量会不一样 所以也不需要硬加 07/21 07:10
15F：→ roy047:可以改用别的方法测 除非以後实验全都换成有GFP的 07/21 07:11
16F：推 heparinase:既然要用MOI, 我会用flow cytometry分析GFP细胞比例， 07/23 08:03
17F：→ heparinase:换算titer 07/23 08:03
18F：→ silverberry:谢谢大家的建议。比较完 Kit 和 ELISA 以後，发现 07/25 12:08
19F：→ silverberry:价格都不太和蔼可亲。GFP 的部分要跟其他同学讨论一下 07/25 12:09
20F：→ silverberry:目前可能会先参考 paper 设计 LTR 的 primer 做 07/25 12:09
21F：→ silverberry:minus strong-stop cDNA 的 qPCR。 07/25 12:12
22F：→ silverberry:先用 viral genome 浓度做参考~ 07/25 12:12