作者llod (so many things)
看板Biotech
标题[求救] trizol抽DNA产量很低, quality也不好
时间Wed Aug 6 16:15:55 2014
想同时从同样的样品里抽DNA 和RNA,所以选了trizol
RNA没问题,但是DNA问题很大
我跟着使用手册做
使用的trizol量是1ml
1. 加入100% EtOH 300ul, 摇匀, 室温incubate 3分钟後12,000rpm 离心5分钟
2. 倒掉上清液, 加入1ml 10% EtOH, 0.1M sodium citrate溶液洗pellet,
室温转30分钟, 12,000rpm离心5分钟
3. 倒掉wash, 加入1ml 75% EtOH, 室温转20分钟, 12,000rpm离心5分钟
4. 倒掉wash, 用p200移掉剩余的酒精,室温放2-3分钟等pellet乾
5. 用 50 ul TE回溶
问题:
1. pellet溶不乾净
2. 抽出来的DNA用RNase A处理过东西剩很少, DNA产量只有直接用kit抽的可能5%
3. 有人用这样的DNA做过NGS的library吗?
烦请有经验的前辈帮我解答疑问
非常感谢!!
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1F：推 Ianthegood:经验就是 不要用trizol抽DNA 08/06 16:36
2F：推 biingru:步骤三那边，室温20min似乎太久？麻烦您确认一下 08/06 16:50
4F：→ llod:如果不用trizol, 有其他方式可以同时抽DNA和RNA又不会太贵吗? 08/06 16:54
5F：推 ko363630:分两个组别 一边抽ＤＮＡ一边ＲＮＡ？ 08/06 17:07
6F：→ sylvialalala:我们lab有用phenol-chloroform方式抽dna送ngs,理论 08/06 17:13
7F：→ sylvialalala:上这是最能保存完整片段以及最大的方法,所以应是没 08/06 17:14
8F：→ sylvialalala:问题(但不是用trizol),同时抽dna, rna有kit(Qiagen) 08/06 17:15
9F：→ sylvialalala:但过membrane就是会让你损失一些片段,我自己有用过 08/06 17:17
10F：→ sylvialalala:trizol同时抽dna跟rna,没有你的问题,dna量很大也很好 08/06 17:17
11F：→ llod:请问syl,你用的protocol是根据invitrogen的还是有其他的? 08/06 17:18
12F：→ llod:kit真的不便宜@@ 08/06 17:19
13F：→ sylvialalala:我是用invitrogen的,不晓得你有没有看protocol说 08/06 17:21
14F：→ sylvialalala:resuspension不能用水或是tris buffer呢？要用8mM 08/06 17:22
15F：→ sylvialalala:NaOH at a concentration of 0.2-0.3 ug/ul? 08/06 17:23
16F：推 biingru:对不起 小弟实在眼残 我找不到75%Etoh转10-20 08/07 09:42
17F：→ biingru:请指点一下 呜呜屋～ 08/07 09:42
18F：→ llod:to syl: 我晚点试试用NaOH, 一直以为那是为了除去RNA 08/07 10:28
19F：→ llod:to biingru: 在DNA wash 第五步到第六步 08/07 10:29
20F：→ llod:还是我眼花了＠＠？ 08/07 10:29
21F：→ llod:to syl:刚刚试完还是不行@@,产量还是很低,看起来是无解了 08/07 16:15
22F：推 mailtea:SERVA有Kit还满好用的 可以试试 08/07 20:07
23F：→ Ianthegood:不能分开抽吗?要送ngs的不要省吧 08/08 00:15
24F：→ bu105330: Tri reagent XD 08/14 19:30
25F：推 htjsu: 用CTAB 10/23 16:29