作者shunminhsu (sharkhsu)
看板Biotech
标题[求救] 抽取 E.coli 的染色体(DNA)
时间Mon Sep 1 15:59:52 2014
小弟抽了几次DNA，但出来的浓度(约35)和260/280(约1.35)都非常低，感觉都没有顺利抽出。
所以想请问各位前辈，还有什麽方式能改善产率呢!?
采用:Protech-Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit给的protocol
步骤如下:
1.将离心後的菌块加入(20mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 1%triton X-100,
20mg/ml lyspzyme) 100μL
2.放置37度30-60 min 3.加入350μL Extraction Buffer
4.加入4μL proteinase K 温和摇晃
5.放置56度1-3h 6.加入300μL DNA binding buffer
7.将溶液转移至spin colimn和collection tube, 14000 rpm 离心1min
丢弃下层液
8.加入700μL Wash Solution 离心丢弃下层液後再离心5 min
9.移去collection tube, 将spin column放置microcentrifuge
10.加入50-100 μL DI水 or TE, 离心1 min後保存
之前有试过用酒精洗一次就好，但效果还是不明显..所以想请问各位前辈
还有什麽方法可以改善的吗!? proteinase有必要再放更久吗!?之前都放三小时..
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.123.126.146
※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1409558395.A.ADE.html
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/01/2014 16:01:22
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/01/2014 16:02:32
1F：→ Invec: E. coli加 proteinase K? 应该要加RNase吧 拿错kit? 09/01 17:28
呃...所以不能用proteinase k吗? 因为我是去其他实验室借kit用的.. protocol上面确
实也写菌是用proteinase k 冏
※ 编辑: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 17:48:45
※ 编辑: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 18:14:26
2F：推 yours8527: 你知道用pk的目的吗? 09/01 20:36
呃 ... 是知道 .. 但无法确定可不可行
※ 编辑: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 20:57:50
3F：推 licat: 在加PK前 溶液应该还是混浊的 PK作用完後会变澄清 09/01 22:03
4F：→ licat: 就你观察 有这样吗? 09/01 22:04
有这个现象没错.. 加完binding buffer後有再离心..瓶底的白色块状挑掉..
但总觉得我在用Wash Solution洗完，整个DNA都不见了..最後加完DI水，
感觉都没有回溶到。
※ 编辑: shunminhsu (114.35.162.46), 09/02/2014 05:13:29
※ 编辑: shunminhsu (114.33.254.137), 09/02/2014 09:14:25
5F：→ Ianthegood: column based就是产量不高 DNA进column离心前摆凉摆久 09/02 10:09
6F：→ Ianthegood: 一点 elution bfr热一点摆久一点 可以提高一点产量 09/02 10:10
7F：→ Ianthegood: 如果真的需要大产量还是用传统法吧 09/02 10:10
谢谢建议，但现在疑惑是染色体DNA抽出来浓度应该要很浓才对...但是我的既不纯
又不浓，这应该不算正常吧!?
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 10:19:53
8F：推 licat: binding buffer 成份是? 原始protocol有说加入後要离心吗？ 09/02 11:52
DNA binding buffer - 20 mL (8M Guanidine HCl), protocol是说有些组织(这边举例班
马鱼、植物纤维)的碎片比较难digest, 所以藉由离心以後再把澄清液放到spin column.
财
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 12:00:49
9F：→ Ianthegood: 你的column就只能抓这麽多啊 09/02 12:22
呃..今天抽出来的值正常多了..但正常DNA要保存在-20还是4度C呢?满多人都说-20,
但又有人说-20会产生冰晶..怕解冻完会影响浓度..
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 12:31:38