作者shunminhsu (sharkhsu)
看板Biotech
标题[求救] PCR跑不出来!! 请各位前辈帮忙..
时间Thu Sep 11 16:28:40 2014
既上次抽染色体的问题解决之後，现在又遇到PCR的问题。
之前抽出的E.coli K12 测nanodrop浓度约:350ng/μL
260/280:2.04 ； 260/230: 1.88
配方如下:
10x buffer:10μL dNTP:10μL primer(50μM):各1μL
KOD:2μL MgSO4:6μL template:3μL DI水:67μL
PCR condition:
95度C 120sec --->denature
55~65度C 60sec---> annealing
72度C 60 sec ---->extension
30 cycle
配成100μL分成10管测温度gradient，但每次跑胶完几乎都没东西。
和老师讨论完的结果，可能是template的量太多。於是又改成1μL去跑，
但跑出来也是全部空的..所以想请问各位前辈问题可能出在哪里!?
去查DNA template的使用浓度说法也都不同..
现在也满担心本身template或primer本身出问题..
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※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:29:29
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:40:47
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:45:21
1F：→ a90648: dNTP浓度多少?之前发生过有人忘记dilute所以跑不出来 09/11 16:50
dNTP:2mM
2F：→ blence: 既然用了KOD，为什麽PCR condition不是照KOD的建议？ 09/11 18:09
呃..实验室学长也是用差不多的条件，所以就没再调整了
3F：→ ko363630: template浓度是um还是nm？ 09/11 20:59
当时测出来的时候是350 ng/uL ..
※ 编辑: shunminhsu (114.35.165.133), 09/11/2014 22:18:11
※ 编辑: shunminhsu (114.33.254.137), 09/11/2014 22:21:02
4F：推 leoblack: 建议你用KOD建议的条件做~太浓的template KOD反而没产物 09/11 22:32
5F：推 ko363630: 同楼上 原ＰＯ真的太浓了 09/12 10:07
6F：→ Ianthegood: template用10% 09/12 10:24
7F：→ Ianthegood: 然後为什麽不把条件列成浓度还要我们帮你算= = 09/12 10:25
因为我不太懂浓度的单位... 去参考每个人的都不同= =
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 10:37:39
8F：→ blence: 各种PCR条件的浓度单位几乎都一样,只有数值的不同 09/12 10:45
9F：→ blence: 如果各家都不同,何不直接参照KOD就好,整篇都没写单位很扯 09/12 10:4
不好意思，这部分我会再注意..
[1;31m→
supray: 单位要弄清楚呀... 09/12 11:49
supray: amplicon多大呢? 09/12 12:33
要P的产物大概950bp，照理不难P才对 冏
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 13:41:50
10F：推 leoblack: KOD建议plasmid的template浓度只要1ng就好~你下了多少？ 09/12 13:42
11F：→ leoblack: genomicDNA只要200ng就好 09/12 13:43
呃... 最後一次dna template是加1μL .. 溶液总量100μL
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:09:16
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:10:10
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:17:03
12F：推 ararthur: 只能建议尽量用"重量"或"浓度"去算 少用体积才不会失了 09/12 15:43
13F：→ ararthur: 重点 09/12 15:43
15F：→ supray: 是上面那组吗? 09/12 17:37
16F：→ supray: 说明都写得很清楚 也有Troubleshooting呀 09/12 17:39
17F：→ Ianthegood: 不管怎麽样换成浓度都比体积好 09/14 17:11
18F：→ freiburg: volume is nothing!! 09/15 04:32
19F：推 a102242002: 我的经验是这样，使用多个浓度的DNA去做PCR,看哪个浓 09/22 17:32
20F：→ a102242002: 度有做出来就使用那个浓度 09/22 17:32
21F：→ satasumi: 1.建议重测浓度 2.起始denature温度跟时间? 09/29 00:16