作者hsinhsien (HH)
看板Biotech
标题[求救] western blot 一片空白
时间Thu Sep 25 16:40:03 2014
各位前辈大家好
我是实验室新手上路
有个问题想问大家
目标是要侦测分子量约78的蛋白
condition如下：
以50-80V runing
以300mA transfer
5%脱脂牛奶 blocking
一抗 1:500 ；GAPDH 1:1000 overnight
PBS wash三次 每次10分钟
二抗1:5000 40分钟
ECL压片 1、3、5分钟
问题是压出来的片子 一 片 空 白
感觉就像是不曾压过片直接冲片一般
我transfer完後有用ponceau S呈色看一下
明明就都有看到band
一抗和二抗也确定都没加错 也都是新鲜配的
请大家救救我 我已经压两次了 都是一片空白
感谢大家帮我回答问题
我是连GAPDH都没压出来
其实我上星期有压出来一次
但这周要repeat data确一直没出来
原本以为是二抗重覆使用的问题
但我今天重配了 确还是一片空白
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1F：→ Bows: 1.你可以问实验室学长姊 2.ECL有不同侦测极限09/25 16:46
2F：→ Bows: 3. 我们压片时间是不固定的，没Band最高加到10min这样09/25 16:47
3F：→ Bows: 5.ECL可能有问题09/25 16:48
大家都用同一罐ECL 所以应该没问题
4F：→ Bows: 4. protein 下的量也会有差09/25 16:49
可是我这次laod 10ul 上次laod 5ul确有出来
5F：→ honey823: 二抗种类有用对吗？若没问题可能是二抗坏了？09/25 17:02
二抗用对 有其他人也有用过
6F：推 Ianthegood: 还是就是没有这个protein09/25 17:10
7F：→ Ianthegood: 有压positive吗?09/25 17:10
8F：推 tsubasawolfy: GAPDH也没有？09/25 18:03
就是连GAPDH都没有才怪啊!
※ 编辑: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:07:32
※ 编辑: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:08:21
※ 编辑: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:09:53
9F：推 tsubasawolfy: 跟别人借底片压压看 kerker 09/25 22:26
10F：→ tsubasawolfy: 让我想到有人把底片拿出来数剩几张的笑话 09/25 22:26
11F：推 greenwind: 洗片机药水剩太少？ 09/25 22:51
12F：推 ko363630: 不是抗体坏了 就是ecl坏了 09/25 23:31
13F：→ Ianthegood: 显影剂定影剂底片 一个一个debug 09/26 01:24
14F：→ blence: 挑剔一下原文没提到2抗是否一样,有没wash,上次GADPH强度? 09/26 02:09
15F：→ blence: 因为是新手,我会猜是前(几)次78kda看太弱,不断加强各浓度 09/26 02:12
16F：→ blence: 之後,GADPH讯号太强早早就烧掉,所以整个反白了 09/26 02:14
17F：推 kakaman: 洗片机换个药剂看看 09/26 02:28
18F：推 Choco1107: 用CCD测啊，看学校可否更新设备 09/27 15:12
19F：推 dennisyoung7: 烧掉的话membrane上面也可以看到烧焦 09/30 15:04
20F：推 eyest: 二抗时间拉长试试看呢 10/02 23:11
21F：推 charliedorae: CCD 10/06 11:50
22F：推 stone1105: 感觉烧掉+1 10/07 14:16
23F：推 machin: 二抗坏掉?lab其他人有无类似问题嘛? 10/07 18:12
24F：推 mrbeachfan: 换别的ecl试试看! 前几个礼拜才发生!Q 10/19 05:57