作者shunminhsu (sharkhsu)
看板Biotech
标题[讨论] 同样条件，PCR第二次却P不出来!?
时间Sat Oct 4 09:47:50 2014
小弟PCR前有做过gradient测试，有成功找出最佳温度。
因此在P产物时，就以此温度下去P。第一次有成功，但不
晓得为什麽，第二、三次就P不出来了..
仪器方面，温度应该是没问题。现在不晓得是不是因为temlpate
反覆冻融太多次，导致DNA(E.coli genomic DNA)都降解掉了..
template 浓度 : 0.84ng/μL (Taq 范围是写10pg-500ng)
浓度应该没错.. 只能请求各位前辈帮忙了..
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.123.126.146
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1F：→ Ianthegood: 你不觉得你给的条件有点模糊吗...? 10/04 12:28
2F：→ Ianthegood: pcr条件 sample怎麽萃的 储存方式 冻融次数 10/04 12:29
sample是用kit抽的，平常和药品(10X buffer,2mM dNTP, 50μM primer) 放在-20保
存。冻融的话，上星期大概开了3-4次..
PCR 条件: 95: 5min, 95: 1:00min, 55: 1min, 72: 10:00min 35cycle
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 10/04/2014 12:50:24
3F：推 huangsw: 我觉得你的cycle设计的怪怪的 72度10分钟x35cycle? 10/04 14:05
4F：→ lail: product很长吧，所以elongation时间长 10/04 21:46
5F：→ RickyKckao: 如果是product很长 一般Taq撑不了那麽久吧!? 10/04 23:17
6F：推 goaremdy: E.coli genomic DNA有这麽容易降解吗@@ 10/05 00:26
7F：推 Invec: phusion 1K/15sec 这酵素哪家的要作到10分钟 我绝不买 10/05 02:56
8F：→ lail: genomic DNA应该是怕断裂吧 10/05 18:36
9F：推 ljii: gDNA保存在TE还是水? 如果是水可能freeze thaw数次後就不稳 10/06 09:22
10F：→ ljii: 另外你product是多长啊? >10kb吗? 你确定第一次p出来的是 10/06 09:23
11F：→ ljii: 产物还是nonspecific band? 10kb用普通Taq去p应该很难 10/06 09:24
我是保存在水里面，真的就怕回融数次後坏掉。 另外产物约为2kb，而72度设定10分钟的话，
是照说明书下去设定的。现在感觉变数很多，不太敢乱调整..
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 10/06/2014 12:07:54
12F：→ RickyKckao: 你的cycle会不会是95:1min 55:1min 72:1min ? 最後才 10/06 14:06
13F：→ RickyKckao: 72:10 min做extension? 10/06 14:06
阿..少打一项! 确实是先72: 1.5min 再 72: 10min
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 10/06/2014 14:15:19
14F：推 yaliu: 不觉得这样冻融次数就会降解...不然你可以再萃一次看看 10/08 19:01
15F：→ yaliu: 我也发生过第一次可以P出来，但之後怎麽试就是不行..或许 10/08 19:02
16F：→ yaliu: 其实错的是第一次....假设所有材料都确定OK，那就只好换 10/08 19:03
17F：→ yaliu: primer了 10/08 19:03
呃..其实当时候有三瓶tempalte，第一瓶用了约4-5次後就P不出来。第二瓶大概2-3次，第三
瓶一次都P不出...
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 10/09/2014 10:26:10
18F：→ xxtomnyxx: 之前实验室有遇过类似的问题，以前都做得出来的 PCR 突 10/10 10:56
19F：→ xxtomnyxx: 然就都做不出来了，除错除很久後发现是 primer 的问题 10/10 10:57
20F：→ xxtomnyxx: ，似乎是该 primer 序列很容易造成降解，重新设计後问 10/10 10:58
21F：→ xxtomnyxx: 题就解决了。 10/10 10:58
序列机率感觉不大 .. 因为有两组primer再P不同产物..但都P不出来 有点冏
※ 编辑: shunminhsu (140.123.126.146), 10/13/2014 15:33:44
22F：→ satasumi: gradian PCR依原本的条件再跑一次,样品放在P出来的位置 09/20 08:08