作者stone1105 (ㄝ..)
看板Biotech
标题[求救] western blot 糊掉
时间Mon Oct 6 13:07:01 2014
各位大家好
目前我的western blot遇到了一些问题
想请大家帮麻找出问题点
这是我的图
http://imgur.com/HyQ71yL
以下是我的实验步骤
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在跑胶时，我是用10%的胶
上胶是60V~80V
下胶是80V~120V
transfer是100V 60~90min结束
blocking是用5%牛奶 室温一小时以上
一抗1:10000 4度C O/N
TBST buffer(0.2% tween20) wash
二抗1:10000 室温一小时
TBST buffer(0.2% tween20) wash
加入 millipore ECL
然後用UVP照胶系统去分析
结果如上面。
我有换过
1.配胶的buffer
2.transfer buffer
可是问题还是一样
所以目前是猜测transfer的电泳槽哪里有问题
另如滤纸、海绵、卡夹、电泳槽本身
过去2年来滤纸一直都有回收重复使用都没问题
但现在甚至只回收一次也会这样
是哪里还有问题吗?
烦请各位帮忙解惑
谢谢
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1F：推 martyrtitan: Buffer过热 10/06 13:08
2F：→ stone1105: 我是在4度C transfer，60min後都还冷冷地。不过下次会 10/06 13:18
3F：→ stone1105: 再注意看看 10/06 13:19
4F：推 nymph: transfer没绑紧? 两边紧了但中间没贴紧? 10/06 13:28
5F：→ biingru: transfer中间没有贴紧 有时候版子用久了会有弧度 10/06 14:11
7F：推 jack33: ransfer中间没有贴紧? 或是刚好有气泡没注意到? 10/06 20:27
8F：推 alaric: 先确定PAGE有没有跑好. 每个wells可能要用buffer冲一冲. 10/06 20:54
9F：推 ko363630: transfer的问题 10/06 23:12
10F：推 im9527tw: 海绵没有平整?我之前出现这样发现是海绵没有平 10/06 23:58
11F：推 Ianthegood: transfer完可以用ponceau S染看看 10/07 12:58
12F：→ supray: 用的membrance需要先泡methanol处理吗? 没泡完全? 10/09 09:48
13F：推 Realthugz: 看似transfer以前的问题 铸胶玻璃和齿梳有对吗 10/11 03:39
14F：→ Realthugz: 也有可能是气泡 10/11 03:40
15F：推 spirithorse: transfer没夹紧+1, 3M paper前後各放两张吧!!(过来人 10/13 00:48
16F：推 mrbeachfan: 去隔壁借别家的transfer用用看吧... 10/19 05:53
17F：→ stone1105: 谢谢楼上的各位，後来换了卡夹跟海绵就没有问题了。 01/12 12:44
18F：→ stone1105: 如果有人有这种问题，可以参考看看!!! 01/12 12:44