作者kevinjeng (Mr.Kai)
看板Biotech
标题[求救] Plasmid跑电泳稀释後位置乱跑??
时间Wed Nov 5 14:52:33 2014
小弟本身主要是做病毒研究，最近在进行clone，抽出plasmid、用enzyme digestion切一
刀把circular form plasmid切成linear form後跑电泳check有没有被酵素切到
原本因为没有切的plasmid是用midi kit抽，所以浓度很高，跑电泳时常变成很亮的一坨，
所以最近有做20X稀释後才放下去跑
结果发生奇妙的状况:
没有稀释的plasmid位置大致上正确(约11k)，但是20X稀释的plasmid位置比起没稀释的竟
然高了一大截，而且几个sample(相同clone的plasmid)状况都一模一样!
除此之外，enzyme digestion product 也很明显没有切到(band的位置低於原本plasmid，
当然也低於20X稀释的原plasmid，
酵素换过全新的，状况相同，所以怀疑是plasmid出了问题
enzyme切位在我的plasmid上确定只有一个在poly-A tail上
因为以往做类似clone(plasmid大小相同、切位相同、酵素相同)没有这种情形，不知有没
有大神可以帮助我一下?原本认为这样一个enzyme digestion是再简单不过的事情，出这
种包让我现在有点不敢面对老板与学长姐们......
谢谢大家~~~
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1F：推 KittyGod: 你叙述的稀释跟没有稀释plasmid有没有酵素切阿 11/05 15:21
稀释跟没有稀释的都没有切，我主要是要看这个酵素有没有切到，把原本没切的plasmid做稀释是想看哪个condition跑电泳看起来比较好看
2F：→ KittyGod: 用酵素切也要约略抓一下plasmid浓度 11/05 15:22
3F：推 Bows: supercoil form? 我之前是没稀释位置不对，稀释後位置才对 11/05 15:24
4F：→ Bows: 是看看切一刀之後再跑大小看看 11/05 15:24
切一刀後，位置反而跑比较下面，就我所知跟我以前的状况都是切完变成linear form後应该要跑得比较慢，这次看起来都比较快......
※ 编辑: kevinjeng (140.116.63.54), 11/05/2014 15:32:54
5F：→ turtle24: 定量一下 有切没切DNA放相同ng跑看看 11/05 18:59
6F：→ milkpa: coil-linear-supercoil 看看到底是那个form 11/05 22:26
7F：推 jabari: 超螺旋族 跟 反螺旋族..... 建议买个螺旋族marker 11/05 23:13
8F：→ blence: 我的经验是10k以下,一般vector,切完位置大都往上跳 11/06 00:42
9F：→ blence: 但是lenti等viral vetor,或一些1Xk以上的plasmid,常猜不准 11/06 00:44