※ 引述《wouldfly (玮玮)》之铭言： : 是这样的... 在看microarray data挑选一些显着差异的candidates : 不免让人想到是怎样分析的，因为data分析前条件的设定，都会牵扯到可信度.. : 有一天有一位前辈跟我说 : http://ppt.cc/H9p9 这样代表会有很多不可信的杂讯进去 : 但重点是我看不多懂这张图~~~~~~ : 我有爬文或查过一些网路上的资料 : 像以下这些资料http://ppt.cc/H9p9 : http://www.slideshare.net/antiplastics/normalization-of-microarray : 或http://genpromarkers.com/Bioinformatics/Bioinformatics.html : 好像就是在解释这个概念 : 但我还是看不懂那个盒须图代表的概念是什麽，上下调整会影响什麽？ : 条件设高设低代表的意思？ : 不好意思~~~拜托懂得大大可以解释，感激QQ "Normalization(正规化)是让数据之间可以比较的前处理" 以qPCR来说，针对housekeeping gene数质的处理就是一种正规化 之所以会有原始数质彼此不能比较的原因 大部分在於operation variation(每次加样的量都不同)跟platform background 过去Microarray 正规化也有人尝试以qPCR的想法，把原始数值跟house keeping相除得到 delta CT，把这个数值当作正规化的数值。 这种想法十分的生物，但是遇到两个问题， 第一个问题:housekeeping gene如何挑选? 高表现的housekeeping gene跟低表现的house keeping gene是不同的， 而正规化的比较标准又要一致， 第二个问题:真的有housekeeping gene吗? 此外每间实验室认为的housekeeping gene都有自己的一套know-how..... 由於housekeeping gene是人定义的，定义方式也不客观 我硕论也被正规化的问题问得很惨，也告诉念生资或念生物的千万不要自己开发统计方法 我们怎麽搞也无法说服统计学家........ 好的! 回来目前通行的正规化方式 目前Micorarray正规化的基本假设是:"大部分的基因表现在所有样品间的差异不大" 换句话说有差异的基因占的比例很低 这个假设舍弃了house keeping gene的概念，用population的概念去让数值之间可以比较 http://genpromarkers.com/Systems_biology/img173.gif 上图是原始数据，下图是正规化的数值 我们看到每笔"原始数值"的population都不同，违反上面提到的假设 正规化後的数值就是调整每样本的数值分布是一样的<-分布!? 讲到分布~ 统计学家又高潮了~ 这就是我硕士论文又拖两个月的原因 每套正规化工具所定义的分布，不同的假设下，数值分布会不同 回来看原始数值，我们可以了解Microaray的数值为何需要正规化 1. 我们可以看到 有些样品的原始数值普遍偏高，这就是我提到operation variation 我们无法肯定每次RNA下的量都一样，因此整体数值就会不同 2. 我们可以看到 有些样品的variaion(iner-quataile range)小，而有些不是 这可能也是hybridization技术的问题(platform background) 因为hybridazation的技术一直有over-saturation及none-specific noise的问题 低表现的基因讯号会高估(因为有非专一的杂讯), 而高表现的基因讯号会低估(饱和问题) 也是有论文认为microarray是一个dynamic range相对不好的技术 (跟qPCR及RNA-seq相比, 我的工作跟NGS相关 趁机酸一下Microarray) 不过microarray的相关资源也比较多，例如GSE, bioGPS 等等db 很多分析工具也很成熟，在一般分析工具上很少人会质疑 而NGS的软体还在蓬勃发展中........ 举个例子来说GSEA的分析 在官方网站方面说: The GSEA team has yet to determine whether any of these ranking statistics,......., are appropriate for use with expression data derived from RNA-seq experiments. (就说不要惹统计学家，统计学家没时间处理的软体就成败自负拉) 所以.....正规化就是这样 有问题就再说吧 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 122.146.55.199 ※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1415216000.A.596.html ※ 编辑: lelojack (122.146.55.199), 11/06/2014 03:40:21 ※ 编辑: lelojack (122.146.55.199), 11/06/2014 03:43:06 我修改文章在顺便题一下NGS表达量的算法 RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads) 其实这个算法真的很单纯，就是用基因的长度和定序的通量进行正规化 由於NGS会读到很多cDNA片段，最直观的计算RNA表现的算法就是去计算cDNA片段的数量 每条cDNA片段就是代表RNA表现的证据 但是这有两个bias: 1.基因越长，片段越多 2.定序总通量越大，所定序到的片段数量也越多 因此计算上真的很单纯 Mapped reads/(基因长度[kb]*定序通量[总条数]) 至於有没有缺点，哥在硕士念完就没认真念论文惹 就等版上的强者来分享拉 ※ 编辑: lelojack (122.146.39.146), 11/06/2014 20:00:26