作者waitingu (Phil-Ku)
看板Biotech
标题[讨论] in vitro system与细胞实验 药物剂量差异
时间Tue Nov 11 17:50:13 2014
由於最近在补一个药物实验的data
看到in vitro kinase assay觉得满好玩的
就来尝试看看 结果却令人有点无法解释:
Compound A在kinase assay可以拉出正常的inhibitor log曲线 换算回去IC50为17 uM
但在细胞实验中 只要2 uM的compound A
即可对此kinase p-Tyr level及其下游蛋白磷酸化有很显着的抑制效果
(IP及WB已重复多次)
令我疑惑的是 通常都是细胞实验或动物实验的剂量
会大於IC50 of kinase activity剂量 (这还满好解释的 像是half-life等等)
但现在情况却反过来 原厂是建议可以调整ATP浓度看看 能不能把log曲线往左右移动
(已经试过调整kinase量，对求得的IC50没有显着差异)
跑去问药理跟药学的同学 她们说还满常碰到这种情形的
也只能把这个data收起来或再repeat看看
想请问一下各位专家们，碰到这种情况该怎麽解释
或是有可以改变的条件让两种实验的浓度不要差太多呢?
感谢！
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1F：→ yuasa: Kinase assay的原理是什麽呢?Sensitivity说不定比较差 11/11 22:01
2F：→ yuasa: 也有可能是像原厂说的condition没有抓得很好 11/11 22:01
我是用Progema的ADP-Glo system
简易版步骤就是:
kinase + inhibitor + ATP反应
然後再加入ADP-Glo这个reagent去反应
最後加入reaction buffer去测冷光
所以可调整的变因大概都在第一个反应那边
3F：→ yuasa: 也有可能compound A不太专一，在细胞内有别的效果出现 11/11 22:02
4F：→ EDaDaDaDaDa: 有没有可能是进入细胞内compound A的量比出细胞的少 11/11 23:12
5F：→ EDaDaDaDaDa: 导致胞内外浓度差，所以实际胞内浓度已经远超过2uM 11/11 23:12
这解释也是有可能 但又要想实验证明(默
6F：推 qiet: 未必是direct target 到那个kinase上, 也可能透过indirect 11/11 23:48
7F：→ qiet: 作用, 如影响更上游 or 加强phoshatase功能等等 11/11 23:48
8F：→ qiet: in vitro 做出来IC50是17uM应该没有人会相信是真的on target 11/11 23:49
没错 这也是我觉得很恐怖的原因
9F：推 Ianthegood: data永远是对的(默) 11/12 00:06
10F：→ blence: 其实整篇看不懂原厂指的是哪一个,compound? kinase? kit? 11/12 00:48
11F：→ blence: 文中提到原厂建议调整ATP,你却调整kinase,好像鸡同鸭讲 11/12 00:50
我第一次实验先做了ATP conversion standard curve & 原厂建议的kinase量
发现偏高以後 将kinase量减半 其他条件相同 再做一次实验 发现结果差不多
才致电原厂 并得到可以从ATP量下手的建议 XD
※ 编辑: waitingu (140.122.143.252), 11/12/2014 09:51:55