作者aaaazzzz (找英文家教)
看板Biotech
标题[求救] 请教transfection失败的原因
时间Tue Dec 2 15:19:59 2014
请教各位先进，
我想要knockdown Axl(属於一种receptor tyrosine kinase)，
使用plasmid pLKO.1与Polyjet(一种reagent)，
实验分成control(不处理), scramble control(空的vector), knockdown
结果相较於control，scramble control与knockdown这两组的Axl(target gene)都有
下降(但我预期看到的是仅仅knockdown这组有下降)
想请问可能的原因有哪些？
PS:
(1)scramble control学理上要放non-target sequence，但实验室没有这种control
(2)先前实验室有做过GFP测试是OK的，约在transfection 24小时候收细胞
(3)transfection时间的排程:如今天下午五点transfect(plasmid与polyjet in
serum-free medium, 然後放入有serum的medium 1cc)，明天下午早上八点换medium，
後天早上八点收细胞，通常都会看到有transfect的组别细胞会死3-5成
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1F：推 Elvis76: 我建议你降低polyjet 的量再做一次看看，有时候过多的rea 12/02 22:18
2F：→ Elvis76: gent 会影响细胞的基因表现。 12/02 22:18
3F：→ aaaazzzz: 您的建议听起来合理,一般建议polyjet:DNA around 3:1 12/02 22:28
4F：→ aaaazzzz: 虑您的建议，谢谢！ 12/02 22:30
5F：→ aaaazzzz: 本实验室先前测试4:2效果最好(是前辈,不是我)，我会考 12/02 22:32
6F：→ blence: "做过GFP测试是OK?" 是指一般cds vector而不是shRNA吧？ 12/02 23:49
7F：→ blence: shRNA都偏大,如果用一般GFP测试OK,应该只能说polyjet可用 12/02 23:51
8F：→ blence: 要反映出4:2的比例最好,可能很没说服力 12/02 23:52
9F：→ blence: 尤其GFP又只做24小时,这应该只看有表现而不是表现比例吧? 12/02 23:53
10F：→ blence: 我用几家不同的经验都显示plasmid越大,对应reagent该越多 12/02 23:56
11F：→ blence: 以上不见得解决眼前问题,只是觉得既有的测试设计并不适当 12/03 00:05
12F：→ aaaazzzz: 所以请问B大对我的实验,vector就造成target gene表现下 12/03 00:39
13F：→ aaaazzzz: 降,有没有具体的测试方法或可能原因，谢谢！ 12/03 00:40
14F：推 scherzoinb: 不负责任的建议︰做不同时间点收细胞来看表现量 12/03 16:45
15F：→ scherzoinb: 也许你就会知道什麽时间收细胞会比较好 12/03 16:47
16F：→ scherzoinb: 还有表现量下降，是用Q-PCR测的吗？差很多吗？ 12/03 16:50
17F：推 scherzoinb: scramble、knockdown的下降量会差很多吗？ 12/03 16:56
18F：→ aaaazzzz: 表现量是从protein来看,scramble与knockdown相较於contr 12/04 13:44
19F：→ aaaazzzz: ol约下降1/3,但knockdown与scramble两者差不多 12/04 13:48
20F：→ aaaazzzz: 如果用RT-PCR加上跑电泳与Image J定量,control,scramble 12/04 13:49
21F：→ aaaazzzz: knockdown三者差不多 12/04 13:50
22F：→ blence: 顺便在问一个无助解决的你推文疑问的,你已经确定shRNA可用 12/04 18:40
23F：→ blence: 了吗？ 通常这类实验不work,transfection并不是优先烦恼的 12/04 18:41
24F：推 Realthugz: housekeeping gene结果正常吗? 12/05 03:00
25F：推 scherzoinb: 默默地推bl大，如果是我的话，我会另外做几组把抗生素 12/05 14:17
26F：→ scherzoinb: 的量，加到2倍、3倍等，然後你要想你要做的是 12/05 14:20
27F：→ scherzoinb: transient transfection或stable transfection？ 12/05 14:22
28F：→ scherzoinb: 再去看一下抗体认的位置是在knockdown序列之前， 12/05 14:23
29F：→ scherzoinb: 还是在knockdown序列之後？scramble多放几天看表现量 12/05 14:25
30F：→ scherzoinb: 会不会变得跟normal差不多？ 12/05 14:26
31F：→ scherzoinb: 还有就是RT PCR的primer，要跨过knockdown的序列， 12/05 14:28
32F：→ scherzoinb: 这样你才会知道knockdown有没有效果， 12/05 14:29
33F：推 scherzoinb: 从你RT PCR的结果，很难推定你的knockdown是有效的~~~ 12/05 14:36