※ 引述《aaaazzzz (找英文家教)》之铭言： : 标题: [求救] 请教transfection失败的原因 : 时间: Tue Dec 2 15:19:59 2014 : : 请教各位先进， : 我想要knockdown Axl(属於一种receptor tyrosine kinase)， : 使用plasmid pLKO.1与Polyjet(一种reagent)， : 实验分成control(不处理), scramble control(空的vector), knockdown : 结果相较於control，scramble control与knockdown这两组的Axl(target gene)都有 : 下降(但我预期看到的是仅仅knockdown这组有下降) : 想请问可能的原因有哪些？ : : PS: : (1)scramble control学理上要放non-target sequence，但实验室没有这种control : (2)先前实验室有做过GFP测试是OK的，约在transfection 24小时候收细胞 : (3)transfection时间的排程:如今天下午五点transfect(plasmid与polyjet in : serum-free medium, 然後放入有serum的medium 1cc)，明天下午早上八点换medium， : 後天早上八点收细胞，通常都会看到有transfect的组别细胞会死3-5成 因为推文的方式有点乱，所以我重打了一些内容， (半年前才开始使用pippe，很多实验细节不同请见谅) 我想请教的，还包含时间与细胞量对transfection的重要性， (1)transfection後的时间是否应该拉长?(目前我是在transfection之後15小时换新的 medium,再隔24小时收细胞，是否应要拉长至48或72小时效果会较好？但我control(没有 transfections)的那一组细胞会爆量，还是说control的细胞种少一些，scramble 与knockdown组别的细胞种多一些？) (2)或者是transfection时的细胞较少会容易成功?(目前我开始transfection时细胞约9 成满,刚好铺一层,我在想transfection成功後的细胞复制时也会被knockdown,这样说 是不是一开始的细胞不要太多，但protocol是说细胞约9成5的时候开始transfection) (3)或者是说transfection只会影响当时的细胞？(如果不影响子代，那应该一开始种细胞 越多越好，然後在transfection隔15小时左右直接收细胞，不需像我目前是隔15小时 换medium，又多等24小时才收细胞) (4)Transfection应该要影响RNA或者是RNA,protein都要影响？(我觉得应该要影响RNA 跟protein，但我的结果对RNA没有knockdown的效果(RT-PCR, 电泳, Image J定量), 只对protein(western)有影响(scramble, knockdown组都影响了，下降量约1/3) (5)关於transfection(knockdown, overexpression)，有没有些知识可从网路上 找到相关参考资料？ : : : -- :

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 210.60.122.151 : ※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1417504802.A.8A0.html : 推 Elvis76: 我建议你降低polyjet 的量再做一次看看，有时候过多的rea 12/02 22:18 : → Elvis76: gent 会影响细胞的基因表现。 12/02 22:18 : → aaaazzzz: 您的建议听起来合理,一般建议polyjet:DNA around 3:1 12/02 22:28 : → aaaazzzz: 虑您的建议，谢谢！ 12/02 22:30 : → aaaazzzz: 本实验室先前测试4:2效果最好(是前辈,不是我)，我会考 12/02 22:32 : → blence: "做过GFP测试是OK?" 是指一般cds vector而不是shRNA吧？ 12/02 23:49 : → blence: shRNA都偏大,如果用一般GFP测试OK,应该只能说polyjet可用 12/02 23:51 : → blence: 要反映出4:2的比例最好,可能很没说服力 12/02 23:52 : → blence: 尤其GFP又只做24小时,这应该只看有表现而不是表现比例吧? 12/02 23:53 : → blence: 我用几家不同的经验都显示plasmid越大,对应reagent该越多 12/02 23:56 : → blence: 以上不见得解决眼前问题,只是觉得既有的测试设计并不适当 12/03 00:05 : → aaaazzzz: 所以请问B大对我的实验,vector就造成target gene表现下 12/03 00:39 : → aaaazzzz: 降,有没有具体的测试方法或可能原因，谢谢！ 12/03 00:40 : 推 scherzoinb: 不负责任的建议︰做不同时间点收细胞来看表现量 12/03 16:45 请教不同时间点的意思？是要延长post-transection的时间吗？ 这样的间隔差不多要几小时才适当？ : → scherzoinb: 也许你就会知道什麽时间收细胞会比较好 12/03 16:47 : → scherzoinb: 还有表现量下降，是用Q-PCR测的吗？差很多吗？ 12/03 16:50 : 推 scherzoinb: scramble、knockdown的下降量会差很多吗？ 12/03 16:56 : → aaaazzzz: 表现量是从protein来看,scramble与knockdown相较於contr 12/04 13:44 : → aaaazzzz: ol约下降1/3,但knockdown与scramble两者差不多 12/04 13:48 : → aaaazzzz: 如果用RT-PCR加上跑电泳与Image J定量,control,scramble 12/04 13:49 : → aaaazzzz: knockdown三者差不多 12/04 13:50 : → blence: 顺便在问一个无助解决的你推文疑问的,你已经确定shRNA可用 12/04 18:40 : → blence: 了吗？ 通常这类实验不work,transfection并不是优先烦恼的 12/04 18:41 先前实验室都说可以knockdown(最近做的学姊约在一年前实验，两个月前 离开本实验室罗，目前仅把plasmid重测浓度，没继续做GFP，说实话，我目前也不会做 GFP测试，想赶时间，所以都相信实验室的东西是OK的) : 推 Realthugz: housekeeping gene结果正常吗? Housekeeping gene一致 : 推 scherzoinb: 默默地推bl大，如果是我的话，我会另外做几组把抗生素 12/05 14:17 : → scherzoinb: 的量，加到2倍、3倍等，然後你要想你要做的是 12/05 14:20 : → scherzoinb: transient transfection或stable transfection？ 12/05 14:22 我要做的是transient transfection，S大您提到的抗生素， 是指制作的plasmid没有达到knockdown的效果吗？ (抱歉,没做过plasmid合成实验,刚接触实验没多久,不是很清楚您的意思) : → scherzoinb: 再去看一下抗体认的位置是在knockdown序列之前， 12/05 14:23 : → scherzoinb: 还是在knockdown序列之後？scramble多放几天看表现量 抗体辨认的位置会有影响吗？knockdown不是整个表现就会下降？ 所以是说当初primer设计的位置可能有问题？ : → scherzoinb: 会不会变得跟normal差不多？ 所以您的意思是延长post-transfection的时间,我的scramble有可能跟control会一致？ : → scherzoinb: 还有就是RT PCR的primer，要跨过knockdown的序列， 12/05 14:28 : → scherzoinb: 这样你才会知道knockdown有没有效果， 12/05 14:29 这是考量到primer设计吗？ : 推 scherzoinb: 从你RT PCR的结果，很难推定你的knockdown是有效的~~~ 12/05 14:36 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 210.60.122.151 ※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1417767569.A.F05.html