作者gto33456789 (太人生了)
看板Biotech
标题[求救] 蛋白质表现出来做成抗体染IHC的问题
时间Thu Dec 11 15:29:32 2014
大家好
最近收到之前 把表现出来的蛋白质给抗体公司 做成的抗体
拿来试染
我用的是Biogenex的系统 用DAB呈色
先拿PCR阴性的片子来试染
把原液稀释5000X 10000X 25000X 50000X来试染
看背景有没有上
想不到染出来,整片有组织的地方都上了..又稠又浓
根本无法辨认
请问我下一步 该怎麽trouble shooting..
因为失败所以还有一个疑问:
我自己生产出来的一抗, 可以接上comerical kit的二抗吗
谢谢
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1F：→ blence: 有做过用lysate与其他如WB测试效力或专一性吗？ 12/11 20:11
2F：推 blence: 这样问是无助於解决IHC问题,但应该没算超出你的问题范围 12/11 20:21
3F：推 caesar0926: 同一楼 先做wb至少看一下会有几条band 12/11 22:01
4F：→ caesar0926: 自己产的抗体物种对 买来的二抗是可以认的到的 12/11 22:03
5F：→ caesar0926: 还有DAB呈色时间要抓一下 有时会太强 12/11 22:05
6F：→ caesar0926: 另外想到你有用3% H2O2 这个步骤吗? 12/11 22:06
7F：→ caesar0926: 上面%数不确定(更正一下 12/11 22:06
8F：→ Ianthegood: 二抗前wash久一点... 可以洗到两三天 12/11 23:11
9F：→ jabari: 1.先作western 2.你的蛋白如何表现纯化 可以说明一下吗@@? 12/12 18:04
10F：→ jabari: 我前lab有人请公司作一抗 然後丢给他们SDS-PAGE切下来的胶 12/12 18:05
11F：→ jabari: 搞了很久才知道原来是彼此都没纯化XD~ 重用一批就好多了 12/12 18:06
12F：→ skyken10: 如果以上方法都无法解决问题，可以试着用你原本的抗原 12/12 20:27
13F：→ skyken10: 对抗体进行纯化。因为IHC的抗原都是folding完整的，应 12/12 20:27
14F：→ skyken10: 该会与你纯化的抗原非常相似，所以经过的纯化的抗体会 12/12 20:27
15F：→ skyken10: 比较好使用！ 12/12 20:27
16F：推 abcam: 可考虑用DAKO的 二抗……我认为 好用 。背景值又乾净。大 12/12 22:03
17F：→ abcam: 推……现在的代理商 比之前的代理商 便宜 超多的！又专业:- 12/12 22:04
18F：推 jabari: 保吉@@? abcam自家没有推荐货吗?? XD~ 12/12 22:05
19F：→ gto33456789: 有用lysate做WB, 都OK 12/13 04:03
20F：→ gto33456789: DAB我可以试试时间少一点 谢谢, 有H2O2这步骤 12/13 04:03
21F：→ gto33456789: PAGE的产物是通管柱, histag来抓的纯化产物 12/13 04:05
22F：→ gto33456789: 现在只有第六针的sample,之後全采血才会抗体纯化 12/13 04:06
23F：→ gto33456789: 我用DAKO的二抗没错, 蟹蟹大家 我继续找问题 12/13 04:06
24F：→ gto33456789: 纯化是E.coli的系统 12/13 04:09
25F：→ gto33456789: 更正: 表现是用E.coli的系统 12/13 04:09