目的是为了替除掉特定的目标蛋白。 使用的菌种是E. coli K-12 所使用的KIT是Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit http://www.genebridges.com/products/quick-easy-e-coli-gene-deletion-kit 基本上我都按照上面的protocol去做， 前面送重组质体的部分， 已经很顺利地送了进去， 也有作对照的部分， 原本的菌种是没有抗amp抗性的表现， 培养时温度也都控制在30度， 也有拿温度计做校正。 主要是在第二次电穿孔时， 送进去PCR好的片段进入， 这个片段有先跑胶，并切胶纯化出来。 使用的纯化KIT是 GeneMark的DNA Clean/Extraction KIT 也全部都按照此上面建议使用， Elution solution也是使用KIT所附上的。 测量OD260时， 因为浓度过低， 添加的体积约为3~6ul的使用。 电穿孔也是按照原本protocol所述1350V， 但是因为我们的机器没有办法调整ms的时间， 有时会到10ms， 主要是做了数次後， 再涂盘後， 还是都没有clone的产生。 请问， 会是我的primer设计有错误? 还是我的PCR条件有问题? 我的PCR是使用ACCU DNA POLYMERASE， 也有请教过有含有高保真性质的能力。 条件是 一开始 5分钟 95度， 接下来30cycle 95度30秒 60度30秒 70度2分钟 之後 70度7分钟 跑胶後， 在大约1.5K之上有一条BAND产生， 但是在低於0.5K之下有一团模糊的团块。 我有针对这个部分做了切胶。 只是之後浓度颇低， 所以添加的体积略高於原厂的建议值1~2ul。 想请问使否会有所影响? PCR的条件要在改变? 还是我原本的primer设计失败? 辨识位置的50bp过短? 请问我这样还有哪里要改善的或是有重大问题? 或是请教大家有无好的浓缩片段方式? 感谢大家了~~ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 120.107.165.123 ※ 文章网址: http://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1418621705.A.B4E.html