大家好~ 目前我的实验是重组E.coli的特定蛋白， 做修改及探讨。 使用的KIT是 http://www.genebridges.com/products/quick-easy-e-coli-gene-deletion-kit 在之前送进了会产生重组蛋白的质体， 也做过特异性比对， 原本的菌株是没有抗AMP抗性的， 问题在於送进第二段的PCR产物後， 几乎完全没有clone的产生。 我所使用的是根据KIT上建议的primer设计， 是在真正参与PCR作用的20个bp的primer上在增加50bp去做两端辨识交换的位置， 所以会产生约70bp的primer， 而所使用的template是根据KIT给予的plasmid， 所使用的是ACCU DNA polymerase， 10X Buffer 5ul 最终1X 10mM dNTP 0.5ul 最终0.1mM Primer 各1ul 最终0.2uM template 1ul (KIT表示浓度50ng/ul) ACCUpolymerase 0.5ul 灭菌过 二次水 补足50ul 也有试过KOD-PLUS-， 10X buffer 5ul 1X 2mM dNTP 5ul 0.2mM 25mM Mg2SO4 2ul 1.0mM primer 各1.5ul 0.3uM template 1ul (KIT表示浓度50ng/ul) KOD -plus 1ul 灭菌过 二次水 补足50ul PCR条件为 95度 5分钟 ----- 95度 30秒 60度 30秒 70度 2分钟 ----- 以上30 cycle 70度 10分钟 4度保持 问题在於出来的浓度都不高 电泳跑胶後， 根据mark似乎是正确的位置， 只是在0.5K以下的位置有一团模糊的团块， 也有以KIT做完切胶纯化後， 以电穿孔方式送入。 发现可供挑选的clone比预期少很多。 筛选用抗体是kanamycin 15ug/ml， 挑选完後， 抽完DNA後已PCR方式去分析发现， band依旧并无改变， 目前似乎最大的问题是在PCR的产物上有无正确的产生我要的产物。 请问 我该如何以plasmid为模板正确的设计出我要的PCR产物? 还有哪些条件需要设计或改变的? 感谢 --

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