作者t123401221 (沉默玩具)
看板Biotech
标题Re: [方法]请问WB的band要怎样压片让他看起来比较圆?
时间Wed Jan 7 10:25:58 2015
※ 引述《t123401221 (沉默玩具)》之铭言：
: 请问各位先进
: 我要看大约38KDa的分子GAPDH
: 跑12.5% SDS-PAGE 电压80 V
: 但transfer完膜染ponceau S都可以看到明显的band
: 接着就是接抗体1抗1:1000 o/n 二抗1:12000 室温1小时
: 但是手洗压片,压个五分钟
: 压出来的band都很弱而且band都扁扁的
: 而且band跟band之间都没有间距看起来好像都连在一起
: 可以麻烦各位帮我解决这个问题吗??
: 谢谢各位^^
各位,我第一次贴图如有不对的地方敬请见谅唷^^
http://ppt.cc/lZdl
这是GAPDH 一抗1:1000
可以请各位帮我解决这问题吗?
谢谢大家^^
--
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1F：推 ko363630: 感觉定量不太准确,而且用到1:1000还这麽淡.不是量太少 01/07 11:23
2F：→ ko363630: 就是抗体太烂了,transfer membrance也有差 01/07 11:25
3F：→ t123401221: 请问该怎麽改善定量问题阿?我的protein OD 595nm 01/07 11:50
4F：→ t123401221: 测出来都差没多少耶?? 01/07 11:52
5F：→ t123401221: 各位transfer条件都是甚麽呢?我方法100V 1hr transfer 01/07 11:53
6F：→ dream903: 如果地量差不多也有可能是loading的问题，看你loading 01/07 11:53
7F：→ t123401221: buffer里有SDS之後再换成30V 30min buffer 里无SDS 01/07 11:54
8F：→ dream903: (定量) loading太多可能会从well跑掉 01/07 11:54
9F：→ t123401221: 我loading量都很少耶最多就9ul 01/07 11:55
10F：→ dream903: 若是两侧的band较淡可能是transfer(湿式)时两边没夹紧 01/07 11:56
11F：→ dream903: 看起来band有点糊糊的，建议下胶制胶时凝久一点 01/07 11:58
12F：→ dream903: 不然就是你的Tris buffer pH值跑掉了，要校正 01/07 11:58
13F：→ t123401221: 但我家助理跟我用一样的条件RUN出来的就很正常 01/07 12:01
14F：推 ljii: transfer伏特数好像高了点 我习惯35V 90分 或50V70分 01/07 12:01
15F：→ t123401221: 虽然我们两个的细胞跟实验都不同只有WB实验条件一样 01/07 12:01
16F：→ ljii: 另外要不就是你loading定量没定好就是你胶有问题,不均匀 01/07 12:02
17F：→ t123401221: ljii 你的transfer里有SDS吗?? 01/07 12:05
18F：推 ko363630: transfer 我都用400mv 90min.transfer buffer我习惯会加 01/07 12:08
19F：→ ko363630: sds,可以帮助他更容易transfer过去 01/07 12:08
20F：推 ljii: 没有SDS 01/07 12:13
21F：→ ljii: 不过这很难参考. transfer条件跟你的gel, membrane, transfe 01/07 12:14
22F：→ ljii: 系统有关, 不能一概而论, 要自己抓条件 01/07 12:14
23F：→ ljii: 100V以我们lab常用的gel通常就会过热, 所以我猜你的gel跟我 01/07 12:15
24F：→ blence: 楼上用35V 90分 或50V70分很像semi-dry条件,与原po不同 01/07 12:17
25F：推 ko363630: 对 我的是hofer系统,伏特高.所以我都会放冰箱 01/07 12:22
26F：→ roy047: 定量, loading胶前必先vortex, spin down才不会吸不均匀 01/07 13:45
27F：→ roy047: 或定错量 01/07 13:45
28F：→ t123401221: 谢谢各位的指教！ 01/07 13:48
29F：→ t123401221: 另外想请教各位有没有推荐的method paper或是书可以 01/07 13:49
30F：→ t123401221: 让我参考呢?谢谢各位^^ 01/07 13:49
31F：推 ko363630: CURRENT PROTOCOL? 01/07 14:13
32F：→ t123401221: 请问roy047定量,loading胶前是先vortex还是spin down? 01/07 15:04
33F：→ roy047: sample先vortex确保混匀之後spin down 吸取 01/07 15:56
34F：→ roy047: 因vortex完有些会在管壁上 01/07 15:56
35F：→ roy047: 因为如果不均匀, 吸的protein量就时多时少了, 会造成误差 01/07 15:57
36F：推 ljii: 记得刚学western时loading一直有问题. 後来发现煮完没有spin 01/12 09:55
37F：→ ljii: down, 或是loading时太大力反溅出well, 这些都会影响 01/12 09:57
38F：推 pent: 该不会是antibody摇不均匀的关系吧？ 01/12 12:26
39F：→ zoe77101y: 楼上……它浓度这麽高！很难哦！ 01/13 01:07