各位好，小弟的实验接下来会探讨到生长素在水稻根尖的分布 所以打算利用可以辨识IAA的抗体来抓根尖切片组织中的IAA， 整个实验过程有几个问题想问一下各位， 然後最底下是我目前搜寻参考资料後整理出来後的PROTOCOL 还麻烦各位多多指导 1. paraformaldehyde可以用formaldehyde取代吗? 看上面一些相关的文章，好像是可以，不过确保起见还是再这边问一次 2. EDAC [ 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide ] 此化合物用途为固定组织内的IAA (以及ABA之类的贺尔蒙) 我问了台湾代理SIGMA的厂商，他说他们只卖EDAC-Hydrochloride 或者其他相关的衍生物，就是没有单纯卖EDAC， 请问用EDAC的衍生物会有一样的效果吗? 或者有没有其他也具有EDAC效果的化合物呢? 3. protocol中说要使用百分之百的纯酒精来进行切片的脱水 可是目前sigma也只有产99.99%的酒精 差了那麽一点点的酒精，对於切片与後续抗体染色处理会有影响吗? --------------------------------------------------------------- 以下是我整理的protocol [样本前处理] 1.将取下之材料以4% (w/v) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC; Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 之PBS缓冲溶液 (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 7.9 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4， pH 7.3) 置於冰上浸泡1小时。 2.以3% (w/v) paraformaldehyde，4% (w/v) EDAC，0.1% (v/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 浸置取下之样本，置放4℃下24小时。 [包埋与切片] 1. 以PBS 缓冲溶液清洗样本三次，每次十分钟。 2. 依序以25, 50, 75, 100% 乙醇浸泡样本，每次处理5分钟，使样本逐渐脱水。 ※ 须以PBS溶液来进行不同浓度乙醇之配置。 3. 於室温中以渐减浓度之ethanol 及 xylene 处理样本， 3-1 以ethanol : xylene ( 3:1 ) 浸泡样本60分钟 3-2 以ethanol : xylene ( 1:1 ) 浸泡样本60分钟 3-3 以ethanol : xylene ( 1:3 ) 浸泡样本60分钟 4. 将样本包埋入cryostat medium (Tissue-Tek, Killik; Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA, USA) 4-1 加入1/4体积之paraplast chips於管中，於室温下隔液培养。 4-2 将样本管置於37℃ 环境中，待paraplast chip完全溶解後， 再加入1/4体积之paraplast chip进入，於室温下培养4小时， 随後再置於42℃环境中培养2小时。 4-3 倒去1/4体积之溶液，再加入1/4体积之parachips，并将以42℃之环境隔夜处理。 ※ 准备paraplast chips 於58℃之环境中，待隔日使用。 4-4 提高温度至48℃，移去1/4体积之溶液，加入paraplast chips，静置4小时。 4-5提高温度至52℃，移去1/4体积之溶液，加入paraplast chips，静置4小时。 4-6提高温度至58℃，移去所有溶液，将样本置入溶解之纯paraplast chips中。 4-7 於2日内更换三次paraplast，於最後一次更换paraplast後，调整样本角度， 完成包埋。包埋之样本密封後可至於常温下长时间保存。 5. 以切片机进行切片，每份样本宽度为50 μm，切片後之样本可置於4℃中保存。 6. 将polysine slides以42℃加热後，滴几滴蒸馏水於其上， 将切片样本至於蒸馏水滴上，使其平整张开。 7. 迅速移去多余水分後，使样本切片在37℃环境中隔夜烘乾。 抗体染色 1. 以25, 50, 75, 100% 乙醇依序清洗，每次5分钟。 2. 以含有0.1% (v/v) Tween 20之PBS缓冲溶液清洗样本30分钟， 再以PBS buffer清洗10分钟。 ※ 除蜡完毕後，确认细胞有无受损，勿用有受损之细胞组织进行抗体染色。 3. 以含有5% (v/v)之bovine serum albumin (BSA; sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)之PBS 浸润样本30分钟，藉以减少non-specific binding。 接着与IAA primary antibody浸润过夜。 4. 浸润完毕後以含有0.1% (v/v) Tween 20之PBS 缓冲溶液润洗10分钟。 5. 将样本以次级抗体於黑暗下浸润1小时。 6. 以含有0.1% (v/v) Tween 20之PBS 缓冲溶液润洗10分钟两次。 7. 润洗完後，立即以显影剂浸润样本。 8. 即可以解剖显微镜进行观察。 --

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