作者iMed (so sad)
看板Biotech
标题Re: [闲聊] mammalian cell lysis
时间Tue Jan 13 06:20:53 2015
※ 引述《blence ( )》之铭言：
: 标题用闲聊，是想帮别人询问一个看法
: 以我的了解，从culture dish收lysate有两种不同的习惯
: 一种是先加入PBS後，将细胞收集到eppendoff，之後才lyse
: 由於我是习惯用第一种方法
: 而另一种是PBS洗後，直接lyse on dish
: 想请问如果是後面那种，对於35或60mm dish会建议lysis buffer至少多少量才适合？
: 或假如使用100ul，通常回收的体积会偏高或偏低？
: 如果变低还可以当作buffer lose而不去管
: 遇到体积变高会不会觉得怪怪的？
我是用第2种方法 通常回收的体积都会变多
我的推测是:
1.PBS洗後没有移除乾净
2.冰上跟室温的温差太大 造成水气的凝结
因为我把PBS移除後，通常会把dish倾斜於冰上，等3-5分钟
就还可以吸到少量从壁上慢慢流下来的PBS
偏高的情形就能改善
至於lysis buffer量的问题我是参考abcam的western blot protocol
1 ml per 10^7 cells/100 mm dish/150 cm^2 flask;
0.5 ml per 5x10^6 cells/60 mm dish/75 cm^2 flask
不过有时会发生药物处理组高浓度的部分收到的lysate太稀
导致一个well loading不了那麽多sample的情形@@
可是实验室又没有特殊的离心管或之前一位神版友分享的特殊滤膜可以离心
希望有版友能解救一下
另外想藉着这个主题问一下
请问大家lysis後会再用超音波震碎吗？
我有震的话 高速离心後收的的碎片较集中 呈深褐色
没有震的话 碎片的上方总是会多一点白白稠稠的东西@@ 不知道那个要不要收？
希望版友也能分享一下
谢谢^^
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1F：推 gps0110: 我做wb会用urea sds 收 可以用很小的volume 01/13 08:03
2F：推 gps0110: 不过用urea收不太好定量就是了 01/13 08:05
3F：推 gps0110: 白白稠稠的应该是 genomic DNA 除了sonication可以加点DN 01/13 08:18
4F：→ gps0110: ASE 01/13 08:18
5F：→ blence: 高速离心後的cell debirs会呈现深褐色？ 01/13 20:09
6F：→ iMed: 嗯嗯 我收下来的是这样 算是土黄色吧@@ 谢谢gps的解答 01/14 05:15
7F：推 chaunen: 深色dibris应该是震到焦掉了 之前震gDNA 做ChIP也是这样. 01/15 07:08
8F：→ chaunen: 不过我的细胞lysis&离心完都会有像lipid的白色渣浮在上面 01/15 07:10
9F：→ chaunen: 稍为votex一下 液体就变得混浊 bradford或BCA定量就不准 01/15 07:13
10F：→ chaunen: 有人遇过吗Q_Q" 01/15 07:14