※ 引述《iMed (so sad)》之铭言： : ※ 引述《blence ( )》之铭言： : : 标题用闲聊，是想帮别人询问一个看法 : : 以我的了解，从culture dish收lysate有两种不同的习惯 : : 一种是先加入PBS後，将细胞收集到eppendoff，之後才lyse : : 由於我是习惯用第一种方法 : : 而另一种是PBS洗後，直接lyse on dish : : 想请问如果是後面那种，对於35或60mm dish会建议lysis buffer至少多少量才适合？ : : 或假如使用100ul，通常回收的体积会偏高或偏低？ : : 如果变低还可以当作buffer lose而不去管 : : 遇到体积变高会不会觉得怪怪的？ : 我是用第2种方法 通常回收的体积都会变多 : 我的推测是: : 1.PBS洗後没有移除乾净 : 2.冰上跟室温的温差太大 造成水气的凝结 : 因为我把PBS移除後，通常会把dish倾斜於冰上，等3-5分钟 : 就还可以吸到少量从壁上慢慢流下来的PBS : 偏高的情形就能改善 : 至於lysis buffer量的问题我是参考abcam的western blot protocol : 1 ml per 10^7 cells/100 mm dish/150 cm^2 flask; : 0.5 ml per 5x10^6 cells/60 mm dish/75 cm^2 flask : 不过有时会发生药物处理组高浓度的部分收到的lysate太稀 : 导致一个well loading不了那麽多sample的情形@@ : 可是实验室又没有特殊的离心管或之前一位神版友分享的特殊滤膜可以离心 : 希望有版友能解救一下 : 另外想藉着这个主题问一下 : 请问大家lysis後会再用超音波震碎吗？ : 我有震的话 高速离心後收的的碎片较集中 呈深褐色 : 没有震的话 碎片的上方总是会多一点白白稠稠的东西@@ 不知道那个要不要收？ : 希望版友也能分享一下 : 谢谢^^ 另外,想请教一个问题 各位将lysis buffer後会反覆pipetting,之後会再拿去sonication吗? 然後,在冰上作用30~60min 後,各位的的离心条件都是多少转速和时间呢?? 因为我查询了相关的文献或是protein protocol 上面写的都是10,000~13,000xg 5~10min --

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