作者vantis (凡提斯之猫)
看板Biotech
标题[讨论] akaline phosphatase activity assay
时间Thu Jan 22 16:05:46 2015
大家好!
小第的老板想要探讨osteogenic differentiation
最近打算购买Alkaline Phosphatase Assay Kit (Colorimetric),Abcam
但该组kit没有提到关於cell sample前处理方法
目前参考一些protocol跟paper,想请问板上的各位神人,下面设计的前处理方式是否ok?
1.wash monolayer cell in 24 well(1*10^4/well) with PBS twice
2.add 300ul 1% triton X-100 in PBS (lysis buffer)
3.scrapping cell and incubation on ice for 1.5 hr
4.2000g, 15min, 4℃ centrifugation
5.测定supernatant protein concentration
6.依Kit说明书测定Alkaline Phosphatase含量
另外还有一些关於此实验的疑问
有些paper中有看到加了lysis buffer(0.1~0.2% triton X-100),会冷冻解冻三次
如果我用1% triton X-100还需要冷冻解冻吗?
另外关於sample normalize有点疑惑,请问是测定total protein浓度後,
以lysis buffer将sample调整到相同浓度并取等量进行酵素活性测定(类似WB的定量方式)?
还是无须调整sample直接取等量跑完酵素活性测定後,再和total protein浓度相除?
麻烦各位协助了!
谢谢!
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1F：→ blence: 网页protocol有写,kit也有附assay buffer让你处理sample喔 01/22 17:01
2F：→ vantis: 眼残@@!谢谢喔! 01/23 05:48
3F：→ vantis: 那请问加了assay buffer要作用多久才会lyse完全? 01/23 05:51
4F：→ vantis: 之後要做total protein定量并依所需量(ug)加入检体 01/23 07:53
5F：→ vantis: 再用assay buffer将体积补到80ul吗? 01/23 07:53
6F：推 Misher: ...好麻烦，我用 sigma 的直接测就行，不用打破细胞。 01/23 23:01
7F：→ Misher: 用Mtt 校正 01/23 23:01
8F：推 Misher: 你那应该是先测酵素活性，再除蛋白量校正吧！ 01/23 23:02
10F：→ Misher: 8?lang=en®ion=TW 01/23 23:05
11F：→ Misher: 我用这个，参考看看。。 01/23 23:05