作者silverberry (平行线上的交集....)
看板Biotech
标题[闲聊] Genome editing - CRISPR/Cas9
时间Fri Jan 23 13:47:37 2015
大家好，标题用闲聊是想听听大家的意见。
如果不合适的话请告诉我，我会修改 m(_ _)m
我的实验室最近想要开始使用 CRISPRC/Cas9，
除了从 addgene 买了相对应的 vector，
为了快速地确认这个技术在实验室是成功的，
我们决定先把有 stable eGFP transfect 的细胞里的 eGFP 做 deletion。
根据 gRNA 设计的原理，
最後挑了四个 gRNA
gRNA1 gRNA2
5'-nnnnnnnnnn 我是 eGFP nnnnnnnnnnn-3'
3'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5'
gRNA3 gRNA4
gRNA1,2 是根据 (+) strain 设计的
gRNA3,4 是根据 (-) strain 设计的
为了确定可以把 eGFP 去掉，
除了一定要的 Cas9 以外，
打算做
gRNA1+
gRNA2
gRNA1+
gRNA4
gRNA3+
gRNA2
gRNA3+
gRNA4 四组 co-transfection
然後再看看哪一组都不亮了、并配合 FACS 跟 genomic DNA PCR 确定真的成功了。
设计这四组 co-transfection，合理吗?
还是我们想太多了?
虽然很可能试了才知道怎麽会成功，
不知道有没有人可以分享一些经验^^
谢谢 m(_ _)m
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1F：→ williamyang: 我的做法是先确认单独的会切,再做送一对的 01/23 14:01
2F：→ williamyang: 至少目前都没失败过 01/23 14:01
3F：→ williamyang: 还有你的cell line要选合适的,HeLa不是适合的 01/23 14:02
4F：→ silverberry: 单独的会切，也是送 cell 里吗? 这样要怎麽确认有切? 01/23 14:37
5F：→ silverberry: 目前是做 CHO cell，之後可能会做 hES or mES 01/23 14:38
7F：推 williamyang: knockout and knockin都是working的 01/23 14:44
8F：→ silverberry: 请问是多大的 knockin? 我希望未来可以把 GFP 01/24 10:49
9F：→ silverberry: 放到 target gene 的後面做 reporter 01/24 10:50
10F：→ silverberry: 还是我先 knockin loxp 之类的序列 比较适合? 01/24 10:50