※ 引述《silverberry (平行线上的交集....)》之铭言： : 大家好，标题用闲聊是想听听大家的意见。 : 如果不合适的话请告诉我，我会修改 m(_ _)m : 我的实验室最近想要开始使用 CRISPRC/Cas9， : 除了从 addgene 买了相对应的 vector， : 为了快速地确认这个技术在实验室是成功的， : 我们决定先把有 stable eGFP transfect 的细胞里的 eGFP 做 deletion。 : 根据 gRNA 设计的原理， : 最後挑了四个 gRNA : gRNA1 gRNA2 : 5'-nnnnnnnnnn 我是 eGFP nnnnnnnnnnn-3' : 3'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5' : gRNA3 gRNA4 : gRNA1,2 是根据 (+) strain 设计的 : gRNA3,4 是根据 (-) strain 设计的 : 为了确定可以把 eGFP 去掉， : 除了一定要的 Cas9 以外， : 打算做 gRNA1+gRNA2 : gRNA1+gRNA4 : gRNA3+gRNA2 : gRNA3+gRNA4 四组 co-transfection : 然後再看看哪一组都不亮了、并配合 FACS 跟 genomic DNA PCR 确定真的成功了。 : 设计这四组 co-transfection，合理吗? : 还是我们想太多了? : 虽然很可能试了才知道怎麽会成功， : 不知道有没有人可以分享一些经验^^ : 谢谢 m(_ _)m 首先，利用Cas9破坏EGFP表现的原理是造成insersion or deletion 然後让EGFP序列发生frameshift，破坏正常胺基酸序列 但有时候Cas9造成的insersion or deletion恰好是3n，所以inframe的结果是EGFP继续亮 其次，因为是transient表现的细胞，所以plasmid在细胞的copy number比较多 就算Cas9逃过了第一点，也很可能因为只切了30%的plasmid，所以EGFP继续亮 所以，我担心你的实验设计无法告诉你太多资讯 比较好的做法是找一个endogenous gene 利用T7E1 assay确定efficiency就好 这样才有机会比较快知道这套系统能不能在贵实验室作用 我自己是用这个方法进行，也没有什麽太大的问题 比较多的经验是做成conditional KO mice及point mutation KI mice 如果大家有兴趣，我们可以再讨论 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.133.10 ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1422007069.A.D55.html ※ 编辑: kaifish (140.112.133.10), 01/23/2015 18:16:11