标题: [求救] QPCR primer设计及PCR检测
时间: Thu Jan 29 12:19:48 2015
事情是这样的
把之前学长设计的 QPCR primer 拿去跑 PCR (以cDNA作为模板)
结果发现有些 primer 的夹出的基因片段很模糊, 有 dimer 或是夹不出来目标片段
老师希望我重新设计引子对,而学长当初是以老师给他的序列 (200-500bp)(早期片段,来源
不明) 来设计引子
因为之後可能会进行 RNAi 的实验, 所以可能需要更长的片段
所以我就拿之前老师给学长的序列拿去 NCBI 做 Blastn
对应到的第一名的序列 Query cover, identity 趴数都很高, 而 E-value 也都很趋近於
0,物种相同,片段长度都有 1000bp 以上
将这些序列送至 Primer Expression 软体进行引子设计(Tm值设定为 58-60度C, primer
长度为 9-40bp,GC content为 30-80%...etc)
跑出来的 primer 有五十名, 但因为前面名次的 primer 会有hairpin, dimer 或
cross dimer, 所以我会往下挑选
可是最後跑出的却夹到许多非目标的大片断或不明显
下图为 PCR 胶图结果
http://imgur.com/IQYc9sm
第一个 well 是 housekeeping gene 做对照的
其他的为我设计的基因 primer, 一个基因 load 两个well
第一行字为基因名称, 第二个为 annealing 温度, 最底下那排为预期长度片段
跑出来好糟糕QQ
还是真的是我太虽 挑到的primer都很差...
恳请版上大大指教与挑错plz
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.4.189
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※ 编辑: zodiac123 (140.112.4.189), 01/29/2015 12:20:36
1F：→ blence: 其实不算很糟糕,其实文章第三句用QPCR primer的片段很模糊 01/29 13:22
2F：→ blence: 就猜想你应该忽略band的清晰度取决於胶的浓度与片段大小 01/29 13:25
3F：→ zodiac123: 忘了说明我使用的是2% TAE 可是做对照的基因都很明显 01/29 13:32
※ 编辑: zodiac123 (140.112.4.189), 01/29/2015 13:33:35
4F：推 jabari: 建议啦.长度过300就不要了 exon-exon的话1-200就好了 01/29 13:48
5F：推 jabari: 再来不不知未来你一盘要跑几个基因 不过pcr阶作个gradient 01/29 13:49
6F：→ jabari: 比较能清楚哪个primer比较好用 建议都跑一次找个最佳化 01/29 13:50
7F：→ jabari: 最後一点 你这gene只有一个transcript??量?? 01/29 13:51
8F：推 jabari: 因为你放的b-tub 我觉得光看semi qPCR的感觉..他的量好像 01/29 13:54
9F：→ jabari: 没有很高耶Q_Q 是用induce後回收再转的cDNA吗? 01/29 13:54
10F：→ jabari: 不过我觉得最後一个还不错啊@_@? 01/29 13:55
11F：→ zodiac123: 最後一个可能是唯一可以忍受的...我要被老师骂惨了QQ 01/29 14:33
12F：→ zodiac123: cDNA是直接以活体抽RNA後RT 01/29 14:34
13F：→ zodiac123: 之後我还会再提高annealing温度跑一次 01/29 14:35
14F：→ zodiac123: 到底为何会夹到大片段QQQQQ 01/29 14:39
15F：推 jabari: 跟pcr和pol有关啊.好的pol 72度跑个20秒就一堆500bp以上了 01/29 15:35
17F：→ supray: 用primer blast确认一下会不会p到其他东西 01/29 20:11
18F：→ supray: 如果你的物种不会太罕见的话 01/29 20:12
19F：推 as862437: 感觉你大片段非专一黏合的比目标多，不够专一? 01/29 21:26
20F：推 supray: 等等 预期长度片段只有60bp? 01/30 08:45
21F：→ supray: amplicon我会挑100bp上下 让它跟primer dimer比较好区分 01/30 08:51
22F：推 Mistletoe921: 上面讲的都对,如果接下来要做qPCR,你的Tm直接抓65度 01/30 16:41
23F：→ Mistletoe921: 上下,50~60度那是一般PCR再用的.如果要用PCR确认引 01/30 16:43
24F：→ Mistletoe921: 子是否能用,Taq别用HiFi的会做出乱七八糟的东西 01/30 16:47
25F：→ Mistletoe921: 你的PCR产物那麽短,跑的胶改用4%吧,ladder看有没有 01/30 16:49
26F：→ Mistletoe921: 50bp或25bp的能用,100的实在看不出来. 01/30 16:50
27F：→ Mistletoe921: 最後既然primer都合出来了,乾脆直接上qPCR跑一个样 01/30 16:51
28F：→ Mistletoe921: 本,然後看anneling curve最快惹~ 01/30 16:52
29F：→ Mistletoe921: 另外,primer设计的部分我会习惯3'用G或C结束 01/30 16:59
30F：推 rodmen: 原Po 鸟松 吴尊推 01/30 17:08
31F：推 jabari: 长度那麽小 用qpcr机器跑个melting比较快 01/30 17:32
32F：→ zodiac123: 谢谢各位大大的回答 有结果再回报给大家 01/31 15:12