作者polomi (polomi)
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标题[求救] 有关PCR的问题
时间Sun Feb 8 20:50:14 2015
版上大家好~
小弟目前正在进行有关E. colo同源重组的实验，
最终的确认是使用PCR判断有无成功的插入到genomic DNA上。
如果是失败的会保留原长度约为1.1KB，
成功的话会改变其长度。
PCR都是使用相同的primer跟相同的温度条件设定。
萃取完DNA後，
也有使用DNA clean kit做纯化的动作。
有测量OD260/280算浓度。
每管每次PCR添加的genomic DNA template都固定约为200~300ng。
使用的polymerase为 ACCU DNA polymerase。
http://www.yeastern.com/Products.php?pid=169&pkid=10&pttype=60
按照原厂建议使用。
primer最终浓度为0.2uM
dNTP 最终浓度为 0.1mM
每次都固定50ul
可是最近几次的PCR都无法出现结果。
有使用先前成功的template做对照。
有附图说明，请参考。
http://ppt.cc/to8T
均为同时跑PCR的结果。
PCR buffer是先除去template跟polymerase外先混合均匀，
再分别添加的。
各项温度的设定并未改变。
请问我有哪里需要再做改变的?
麻烦各位了
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1F：→ scherzoinb: 直接拿菌去跑pcr，如有band，那就是gDNA萃取的问题， 02/08 21:31
2F：→ scherzoinb: 如没有band，那表示重订primer~~~~~~ 02/08 21:32
3F：→ skybreeze: 或者跑一组house keeping gene的primer 测试gDNA 02/08 21:41
4F：→ blence: house keeping gene?? 不知E coli是哪一个gene？ 02/08 21:47
5F：推 as862437: 16s 算吗？ 02/08 21:59
6F：推 as862437: 之前粹的gDNA 也是有跟这次一起重新PCR跑吗?如果有就不 02/09 01:06
7F：→ as862437: 是primer 问题了，应该是萃取过程出问题 02/09 01:07