作者polomi (polomi)
看板Biotech
标题Re: [求救] 有关PCR的问题
时间Wed Feb 11 09:37:54 2015
※ 引述《polomi (polomi)》之铭言：
: 版上大家好~
: 小弟目前正在进行有关E. colo同源重组的实验，
: 最终的确认是使用PCR判断有无成功的插入到genomic DNA上。
: 如果是失败的会保留原长度约为1.1KB，
: 成功的话会改变其长度。
: PCR都是使用相同的primer跟相同的温度条件设定。
: 萃取完DNA後，
: 也有使用DNA clean kit做纯化的动作。
: 有测量OD260/280算浓度。
: 每管每次PCR添加的genomic DNA template都固定约为200~300ng。
: 使用的polymerase为 ACCU DNA polymerase。
: http://www.yeastern.com/Products.php?pid=169&pkid=10&pttype=60
: 按照原厂建议使用。
: primer最终浓度为0.2uM
: dNTP 最终浓度为 0.1mM
: 每次都固定50ul
: 可是最近几次的PCR都无法出现结果。
: 有使用先前成功的template做对照。
: 有附图说明，请参考。
: http://ppt.cc/to8T
: 均为同时跑PCR的结果。
: PCR buffer是先除去template跟polymerase外先混合均匀，
: 再分别添加的。
: 各项温度的设定并未改变。
: 请问我有哪里需要再做改变的?
: 麻烦各位了
不好意思，
可能小弟上次说的不够清楚。
因为目前正在做E. coli同源重组的实验，
是对genomic DNA上的目标基因利用一段具有抗生素抗性基因做取代。
所以，
如果取代失败的话，
用原本的primer去PCR的话，
应该还是原本的片段长度。
而如果取代成功，
片段长度会有所改变。
而预估如果成功的取代了原本的目标基因片段，
会从原本的1KB多变成约2KB左右的长度。
如果取代失败的话，
PCR的结果会直接呈现1KB的band出现，
但是目前的结果PCR後完全没有任何的band产生。
小弟有做了比对的组别，
如图，
http://ppt.cc/to8T
应该可以证明PCR的polymerase与primer没有问题。
是不是要对PCR的其他温度条件与时间做改变。
目前的PCR温度设定条件如下:
第一步:
94度C， 5分钟。
第二步:
94度C， 30秒。
58度C， 30秒。
68度C， 2分30秒。
第三步:
68度C， 7分钟。
结束。
使用的PCR仪器为BIO-RAD My Cycler。
请问，
如果从原先的1点多KB片段长度变成2点多KB，
是不是要修改那些PCR条件。
已经有尝试过将annealing 温度从58调整为 60 62 64过。
也有尝试着将低到55。
但似乎都还是只有比对用的有成功产生band出现。
顺带请问一下，
请问这台PCR如果要做梯度温度的分段PCR，
是不是要再另外购买什麽或是连络厂商才能打开机器的权限?
感谢大家。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 120.107.165.123
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1423618677.A.EEF.html
1F：推 mesenchymal: 题外话: 也可以针对你换进去的片段设计primer 02/11 12:27
2F：→ mesenchymal: 例如F-primer target是Genomic, R-primer则是抗生 02/11 12:29
3F：→ mesenchymal: 素基因 02/11 12:30
4F：→ scherzoinb: 挑几个菌去送定序吧~~~ 02/11 14:07
5F：→ scherzoinb: 你有没有想过会不会是萃取的问题？ 02/11 14:08
6F：→ scherzoinb: 所以才会建议你直接用菌下去p~~~原po加油~~~~~~ 02/11 14:09
7F：→ scherzoinb: 再仔细看看primer夹的位置跟取代位置的关系~~~ 02/11 14:11
8F：→ polomi: 不好意思 想请问 直接用菌下去P的条件要如何控制? 02/11 15:19