※ 引述《licat (licat)》之铭言： : 不好意思因为资讯太少，我想问一些问题便於判断 : 　请问想去除的片段长度多大？ 去除的片段长度约为450 bp， 而使用插入取代的抗性片段约为1.6 KB。 : : 是对genomic DNA上的目标基因利用一段具有抗生素抗性基因做取代。 : 请问是甚麽抗生素基因？使用的互换机制是？ 利用kanamycin 15ug/ml， 互换的机制是同源重组交换的方式。 有一个大陆的网站写得满浅显易懂的， http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology 主要的参考是这篇paper http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079 : 　（抗生素基因是带在质体上？或着你送入的是线状DNA？） : 然後你应该是使用在抗生素盘上长出来的菌落去抽DNA、做後续PCR吧？ 送入的抗性基因是线状的DNA， 主要设计是在取代用的抗kanamycin基因序列前後， 各加上目标取代位置前後各50bp送入。 主要送入方式都是以电穿孔的方式。 　 因主要表现重组蛋白的质体为温度敏感型， 过程中都有注意培养的温度是否有低於30度。 : : 是不是要再另外购买什麽或是连络厂商才能打开机器的权限? : 　我觉得不像是PCR或抽DNA的问题， : 　因为你的control反应很专一，这种PCR你沾一点菌落或菌液直接当模板都做得出来 : 　 : 　所以你没夹出来，我觉得比较可能是 : 　1. 那些长出来的菌落是污染的杂菌，没有你primer可认得的序列 : 　　 （如果你提供详细实验流程跟结果： 那个我有取只含有重组蛋白质体的菌来pcr过， 用原本的primer表现， 的确原本的片段长度约为1KB左右。 应该可以初步排除杂菌的可能性。 还未定序过，也有可能是其他的杂菌。 : 　　 像是怎麽送入DNA？涂盘後生长菌落数？会比较好判断） 都是使用电穿孔的方式， 恩我用附图的方式可以吗? http://ppt.cc/5iBm 请原谅我必须删掉我的目标序列名称。 　　 : 　2. 那些菌落都是insertion mutants，然後你primer座落的位置被互换掉了 : 　　 （这得看primer座落位置跟整个互换的设计） 阿~~~ 希望不要阿。 我连发票都是一整年顶多中一张200的机会啊 QAQ 　 : 　3. 那些菌落都是insertion mutants，primer也没错， : 　　 但PCR反应没有强到可以夹出2 KB大小，所以你可以： : (1) 将annealing降到50，没出来再降到45，再没出来就放弃 : (2) 换别的厂牌的taq，直接测试50跟45度annealing : (3) 重新设计其他primer : 　　 其实原先主要的annealing温度为58度， 现在有尝试过， 50 55 58 60 62 64， 主要都是30秒。 也有尝试着加入DMSO， 其结果如下图: http://ppt.cc/C99u : 　　 我想你可以先测试上述的PCR条件， : 　　 希望你annealing温度一降就夹出来，问题解决~ : 祝实验顺利 感谢您， 我会先尝试着降低温度试试看～ --

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