※ 引述《polomi (polomi)》之铭言： : ※ 引述《licat (licat)》之铭言： : : 不好意思因为资讯太少，我想问一些问题便於判断 : : 　请问想去除的片段长度多大？ : 去除的片段长度约为450 bp， : 而使用插入取代的抗性片段约为1.6 KB。 那你原本设计用来确认重组状况的primer，离置换位置有段距离 会让PCR困难度变高，可以考虑设计得近一点 (不过看你PCR的图，这应该不是做不出来的主因) : : 请问是甚麽抗生素基因？使用的互换机制是？ : 利用kanamycin 15ug/ml， : 互换的机制是同源重组交换的方式。 : 有一个大陆的网站写得满浅显易懂的， : http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology : 主要的参考是这篇paper : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079 我用过这个系统，跟其他互换系统相比没那麽顺利 虽然看起来很简单但不容易除错，DNA电进去後都不知道出了啥事 如果你能找到用得很顺的人，建议直接跟他请教 如果周围没有，而你又是作E. coli，我觉得你换用SacB系统做还比较好 : 各加上目标取代位置前後各50bp送入。 : 主要送入方式都是以电穿孔的方式。 : 　 : 因主要表现重组蛋白的质体为温度敏感型， : 过程中都有注意培养的温度是否有低於30度。 : : 　我觉得不像是PCR或抽DNA的问题， : : 　因为你的control反应很专一，这种PCR你沾一点菌落或菌液直接当模板都做得出来 : : 　 : : 　所以你没夹出来，我觉得比较可能是 : : 　1. 那些长出来的菌落是污染的杂菌，没有你primer可认得的序列 : : 　　 （如果你提供详细实验流程跟结果： : 那个我有取只含有重组蛋白质体的菌来pcr过， : 用原本的primer表现， : 的确原本的片段长度约为1KB左右。 : 应该可以初步排除杂菌的可能性。 以上所述是无法排除的啦 但我猜那些菌落还是你的E. coli，而且有发生重组所以才有Km抗性， 然後你的PCR也才会变成作不出来 只是重组方式跟原本预期的不一样... : 恩我用附图的方式可以吗? : http://ppt.cc/5iBm : 请原谅我必须删掉我的目标序列名称。 : 　　 : : 　2. 那些菌落都是insertion mutants，然後你primer座落的位置被互换掉了 : : 　　 （这得看primer座落位置跟整个互换的设计） : 阿~~~ : 希望不要阿。 : 我连发票都是一整年顶多中一张200的机会啊 QAQ 这跟机率无关，你应该找有经验的人帮你看一下整个互换设计跟引子位置是否正确 : 　 : : 　3. 那些菌落都是insertion mutants，primer也没错， : : 　　 但PCR反应没有强到可以夹出2 KB大小，所以你可以： : : (1) 将annealing降到50，没出来再降到45，再没出来就放弃 : : (2) 换别的厂牌的taq，直接测试50跟45度annealing : : (3) 重新设计其他primer : : 　　 : 其实原先主要的annealing温度为58度， : 现在有尝试过， : 50 55 58 60 62 64， : 主要都是30秒。 : 也有尝试着加入DMSO， : 其结果如下图: : http://ppt.cc/C99u : : 　　 我想你可以先测试上述的PCR条件， : : 　　 希望你annealing温度一降就夹出来，问题解决~ : : 祝实验顺利 : 感谢您， : 我会先尝试着降低温度试试看～ 嗯...多了解後，我觉得改PCR条件的成功机率不高，但还是祝你好运 --

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